Качественные реакции на обнаружение белка в моче

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи. Выявление и количественная оценка протеинурии важна не только в диагностике многих первичных и вторичных заболеваний почек, оценка изменения выраженности протеинурии в динамике несет информацию о течении патологического процесса, об эффективности проводимого лечения. Обнаружение белка в моче даже в следовых количествах должно настораживать в отношении возможного заболевания почек или мочевых путей и требует повторного анализа. Особо следует отметить бессмысленность исследования мочи и, в частности, определения белка мочи без соблюдения всех правил ее сбора.

Все методы определения белка в моче можно разделить на:

Качественные,
Полуколичественные,
Количественные.

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Условия определения белка в моче на основе реакции коагуляции:

Моча должна иметь кислую реакцию. Мочу щелочной реакции подкисляют несколькими (2 — 3) каплями уксусной кислоты (5 – 10%).
Моча должна быть прозрачной. Помутнение устраняется через бумажный фильтр. Если помутнение не исчезает, добавляют тальк или жженую магнезию (около 1 чайной ложки на 100 мл мочи), взбалтывают и фильтруют.
Качественную пробу следует проводить в двух пробирках, одна из них – контрольная.
Искать помутнение следует на черном фоне в проходящем свете.

К качественным методам определения белка в моче относятся:

Как показывают многочисленные исследования, ни один из большого числа известных методов качественного определения белка в моче не позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты. Несмотря на это, в большинстве КДЛ в России эти методы широко используются в качестве скрининга – в моче с положительной качественной реакцией в дальнейшем проводят количественное определение белка. Из качественных реакций чаще используют пробу Геллера и пробу с сульфосалициловой кислотой, однако пробу с сульфосалициловой кислотой большей частью считают наиболее подходящей для выявления патологической протеинурии. Проба с кипячением в настоящее время практически не используется в связи с ее трудоемкостью и длительностью.

В основе метода Брандберга-Робертса-Стольникова лежит кольцевая проба Геллера, поэтому при данном методе наблюдаются те же ошибки, что и при пробе Геллера.

В настоящее время для определения белка в моче все чаще используются диагностические полоски. Для полуколичественного определения белка в моче на полоске в качестве индикатора чаще всего используется краситель бромфеноловый синий в цитратном буфере. О содержании белка в моче судят по интенсивности сине-зеленой окраски, развивающейся после контакта реакционной зоны с мочой. Результат оценивается визуально или с помощью анализаторов мочи. Несмотря на большую популярность и очевидные преимущества методов сухой химии (простота, скорость выполнения анализа) данные методы анализа мочи в целом и определения белка в частности не лишены серьезных недостатков. Одним из них, приводящих к искажению диагностической информации, является большая чувствительность индикатора бромфенолового синего к альбумину по сравнению с другими белками. В связи с этим, тест-полоски в основном приспособлены к обнаружению селективной гломерулярной протеинурии, когда практически весь белок мочи представлен альбумином. При прогрессировании изменений и переходе селективной гломерулярной протеинурии в неселективную (появление в моче глобулинов) результаты определения белка оказываются заниженными по сравнению с истинными значениями. Данный факт не дает возможности использовать данный метод определения белка в моче для оценки состояния почек (гломерулярного фильтра) в динамике. При тубулярной протеинурии результаты определения белка также оказываются заниженными. Определение белка с помощью диагностических полосок не является надежным индикатором низких уровней протеинурии (большинство выпускаемых в настоящее время диагностических полосок не обладают способностью улавливать белок в моче в концентрации ниже, чем 0,15 г/л). Отрицательные результаты определения белка на полосках не исключают присутствия в моче глобулинов, гемоглобина, уромукоида, белка Бенс-Джонса и других парапротеинов.

Хлопья слизи с высоким содержанием гликопротеидов (например, при воспалительных процессах в мочевых путях, пиурии, бактериурии) могут оседать на индикаторной зоне полоски и приводить к ложноположительным результатам. Ложноположительные результаты могут также быть связаны с высокой концентрацией мочевины. Плохое освещение и нарушение цветоощущения может быть причиной неточного результата.

В связи с этим, использование диагностических полосок следует ограничить скринирующими процедурами, а результаты, полученные с их помощью, следует рассматривать лишь как ориентировочные.

Корректное количественное определение белка в моче в ряде случаев оказывается непростой задачей. Трудности ее решения определяются следующим рядом факторов:

низким содержанием белка в моче здорового человека, часто находящимся на пороге чувствительности большинства известных методов;
присутствием в моче множества соединений, способных вмешиваться в ход химических реакций;
значительными колебаниями содержания и состава белков мочи при различных заболеваниях, затрудняющими выбор адекватного калибровочного материала.

В клинических лабораториях преимущественно применяются так называемые «рутинные» методы определения белка в моче, однако они далеко не всегда позволяют получать удовлетворительные результаты.

С точки зрения специалиста-аналитика, работающего в лаборатории, метод, предназначенный для количественного определения белка в моче, должен отвечать следующим требованиям:

обладать линейной зависимостью между поглощением образовавшегося в ходе химической реакции комплекса и содержанием белка в пробе в широком диапазоне концентраций, что позволит избежать дополнительных операций при подготовке пробы к исследованию;
должен быть прост, не требовать высокой квалификации исполнителя, выполняться при малом количестве операций;
обладать высокой чувствительностью, аналитической надежностью при использовании небольших объемов исследуемого материала;
быть устойчивым к воздействию различных факторов (колебаниям состава образца, присутствию лекарственных препаратов и др.);
обладать приемлемой стоимостью;
быть легко адаптируемым к автоанализаторам;
результат определения не должен зависеть от белкового состава исследуемого образца мочи.

Ни один из известных к настоящему времени методов количественного определения белка в моче не может в полной мере претендовать на роль «золотого стандарта».

Количественные методы определения белка в моче можно разделить на турбидиметрические и колориметрические.

К турбидиметрическим методам относятся:

определение белка с сульфосалициловой кислотой (ССК),
определение белка с трихлоруксусной кислотой (ТХУ),
определение белка с бензетоний хлоридом.

Турбидиметрические методы основаны на снижении растворимости белков мочи вследствие образования суспензии взвешенных частиц под воздействием преципитирующих агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния, определяемого числом светорассеивающих частиц (нефелометрический метод анализа), либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Величина светорассеяния в преципитационных методах обнаружения белка в моче зависит от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения pH среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению относительно воспроизводимых результатов.

Некоторые лекарственные препараты влияют на результаты турбидиметрических методов определения белка в моче, приводя к так называемым «ложноположительным», либо «ложноотрицательным» результатам. К ним относятся некоторые антибиотики (бензилпенициллин, клоксациллин и др.), рентгеноконтрастирующие йодсодержащие вещества, сульфаниламидные препараты.

Турбидиметрические методы плохо поддаются стандартизации, часто приводят к получению ошибочных результатов, но, несмотря на это, в настоящее время они широко используются в лабораториях из-за невысокой стоимости и доступности реактивов. Наиболее широко в России используется метод определения белка с сульфосалициловой кислотой.

Наиболее чувствительными и точными являются колориметрические методы определения общего белка мочи, основанные на специфических цветных реакциях белков.

биуретовая реакция,
метод Лоури,
методы, основанные на способности различных красителей образовывать комплексы с белками:
- Понсо S (Ponceau S),
- Кумасси бриллиантовый синий (Coomassie Brilliant Blue)
- пирогаллоловый красный (Pyrogallol Red).

С точки зрения исполнителя, в повседневной работе лаборатории при большом потоке исследований биуретовый метод является неудобным из-за большого числа операций. В то же время, метод характеризуется высокой аналитической надежностью, позволяет определять белок в широком диапазоне концентраций и выявлять альбумин, глобулины и парапротеины со сравнимой чувствительностью, вследствие чего биуретовый метод рассматривают в качестве референтного и рекомендуют для сравнения других аналитических методов обнаружения белка в моче. Биуретовый метод определения белка в моче предпочтительно выполнять в лабораториях, обслуживающих нефрологические отделения, и использовать в тех случаях, когда результаты определения с помощью других методов представляются сомнительными, а также для определения величины суточной потери белка у нефрологических больных.

Метод Лоури, обладающий более высокой чувствительностью по сравнению с биуретовым методом, сочетает биуретовую реакцию и реакцию Фолина на аминокислоты тирозин и триптофан в составе белковой молекулы. Несмотря на высокую чувствительность, данный метод не всегда обеспечивает получение надежных результатов при определении содержания белка в моче. Причиной тому служит неспецифическое взаимодействие реактива Фолина с небелковыми компонентами мочи (чаще всего аминокислотами, мочевой кислотой, углеводами). Отделение этих и других компонентов мочи путем диализа или осаждения белков позволяет с успехом использовать данный метод для количественного определения белка в моче. Некоторые лекарственные препараты – салицилаты, хлорпромазин, тетрациклины способны оказывать влияние на данный метод и извращать результаты исследования.

Достаточная чувствительность, хорошая воспроизводимость и простота определения белка по связыванию красителей делают эти методы перспективными, однако высокая стоимость реактивов препятствует более широкому их использованию в лабораториях. В настоящее время в России все большее распространение получает метод с пирогаллоловым красным.

Проводя исследование уровня протеинурии, нужно иметь ввиду, что различные методы определения протеинурии имеют разную чувствительность и специфичность к многочисленным белкам мочи.

Исходя из эмпирических данных, рекомендуется определять белок двумя разными методами и рассчитывать истинное значение по одной из приведенных формул:

протеинурия = 0,4799 B + 0,5230 L;
протеинурия = 1,5484 B – 0,4825 S;
протеинурия = 0,2167 S + 0,7579 L;
протеинурия = 1,0748 P – 0,0986 B;
протеинурия = 1,0104 P – 0,0289 S;
протеинурия = 0,8959 P + 0,0845 L;

где:
B – результат измерения с Кумасси G-250;
L — результат измерения с реактивом Лоури;
P — результат измерения с молибдатом пирогаллола;
S — результат измерения с сульфосалициловой кислотой.

Учитывая выраженные колебания уровня протеинурии в различное время суток, а также зависимость концентрации белка в моче от диуреза, различное его содержание в отдельных порциях мочи, в настоящее время при патологии почек принято оценивать выраженность протеинурии по суточной потере белка с мочой, то есть определять так называемую суточную протеинурию. Она выражается в г/сут.

При невозможности сбора суточной мочи рекомендуется определять в разовой порции мочи концентрации белка и креатинина. Поскольку скорость выделения креатинина в течение дня достаточно постоянна и не зависит от изменения скорости мочеотделения, отношение концентрации белка к концентрации креатинина постоянно. Данное отношение хорошо коррелирует с суточной экскрецией белка и, следовательно, может использоваться для оценки выраженности протеинурии. В норме отношение белок/креатинин должно быть менее 0,2. Белок и креатинин измеряют в г/л. Важным достоинством метода оценки выраженности протеинурии по соотношению белок-креатинин является полное исключение ошибок, связанных с невозможностью или неполным сбором суточной мочи.

О. В. Новоселова, М. Б. Пятигорская, Ю. Е. Михайлов, «Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии», Справочник заведующего КДЛ, № 1, январь 2007 г.
А. В. Козлов, «Протеинурия: методы ее выявления», лекция, Санкт-Петербург, СПбМАПО, 2000 г.
В. Л. Эмануэль, «Лабораторная диагностика заболеваний почек. Мочевой синдром», — Справочник заведующего КДЛ, № 12, декабрь 2006 г.
В.И. Пупкова, Л.М. Прасолова — Определение белка в моче и спинномозговой жидкости. Кольцово, 2007 г.
Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е. А. Кост. Москва, «Медицина», 1975 г.

Для количественного определения белка пригоден любой образец мочи. Большинство исследователей для выяснения величины суточной потери белка предпочитают определять содержание белка в моче, собранной за сутки.

Раздел: Анализ мочи

Все качественные пробы на белок в моче основаны на способности белков к денатурации под влиянием различных физических и химических факторов. При наличии белка в исследуемом образце мочи появляется либо помутнение, либо выпадение хлопьевидного осадка.

Раздел: Анализ мочи

Проба с 20% сульфосалициловой кислотой относится к качественным реакциям определения белка в моче. Так как она основана на реакции коагуляции, то исследуемая моча должна соответствовать определенным требованиям: быть прозрачной и иметь кислую реакцию.

Раздел: Анализ мочи

Кольцевая проба Геллера относится к качественным реакциям определения белка в моче. Так как она основана на реакции коагуляции, то исследуемая моча должна соответствовать определенным требованиям: быть прозрачной и иметь кислую реакцию.

Раздел: Анализ мочи

источник

Белок в нормальной моче находиться в виде следов, которые не открываются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории. Появление белка в моче называется протеинурией, которая может быть двух видов: «почечная» и «внепочечная». При «почечной» или истинной протеинурии белки сыворотки крови попадают в мочу через почки (при нефрите, т.е. при воспалении клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость; в случае сердечной декомпенсации; при некоторых формах повышенного артериального давления; иногда при беременности). «Внепочечная» или ложная протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя, но не из почек, а из мочевыводящих путей. Белок появляется в моче при нефрите (т.е. воспалении сосудистых клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость), а в случае сердечной декомпенсации, при некоторых формах повышенного кровяного давления и иногда при беременности. Моча, содержащая белок, становится мутной.

Для обнаружения белка в моче обычно применяют три реакции на его осаждение: 1. Осаждение кипячением. 2. Осаждение концентрированной азотной кислотой. 3. Осаждение сульфосалициловой кислотой (самая чувствительная).

v Проба кипячением.

Принцип метода. При кипячении нейтральных или слабокислых растворов белка, последний денатурирует и выпадает в осадок. При денатурации белка нарушаются четвертичная, третичная и даже вторичная структуры, т.е. отмечается разрыв цементирующих белковую молекулу вторичных связей (водородных, дисульфидных, электростатических, эфирных, вандервальсовых и др.), что ведет к изменению пространственной структуры и уменьшению гидрофильности белковой молекулы.

Исследуемый материал и реактивы

1. Патологическая моча. 2. Раствор уксусной кислоты (1%). 3. Раствор уксусной кислоты (10%). 4. Лакмусовая бумага.

Предварительно проверяют мочу на лакмус. Если моча имеет кислую реакцию, то её (2-3 мл) сразу кипятят в пробирке, а если моча имеет щелочную реакцию, то её сначала очень слабо подкисляют на лакмус добавлением по каплям 1% уксусной кислоты. В присутствии белка при кипячении образуется муть или осадок, не растворяющийся при повторном кипячении после добавления к жидкости 3-5 капель 10% уксусной кислоты. Этим осадок свернувшихся белков отличается от осадков фосфатов и карбонатов кальция и магния, которые могут выпасть при кипячении в слабокислой среде, но растворяются при нагревании в более кислом растворе уксусной кислоты.

v Осаждение белка концентрированной азотной кислотой (проба Геллера).

Принцип метода. Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию, что связано с дегидратацией белковых частиц, их нейтрализацией и образованием комплексных солей белка с кислотами Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется.

Исследуемый материал и реактивы

1. Патологическая моча. 2. Азотная кислота (концентрированная).

В пробирку наливают около 1 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно из пипетки по стенке пробирки наливают мочу. В присутствии белка на границе раздела двух жидкостей образуется белый аморфный слой или муть, так называемое белковое кольцо. При отсутствии белка в моче на границе обоих жидкостей появляется цветное кольцо, обусловленное изменением пигментов мочи под действием азотной кислоты.

v Осаждение белка сульфосалициловой кислотой.

Принцип метода. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков обусловленное нейтрализацией заряда белка, что приводит к разрушению пространственной структуры, денатурации и осаждению белка.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы

источник

Нормальные показатели: белок в норме в моче содержится в минимальных количествах, которые не обнаруживаются обычными качественными реакциями. Верхняя граница нормы белка в моче – 0,033 г/л. Если содержание белка выше этого значения, то качественные пробы на белок становятся положительными.

Клиническое значение определения:

Появление белка в моче называется протеинурия. Протеинурии могут быть ложными и почечными. Экстраренальные протеинурии могут быть при наличии примесей белкового происхождения из половых органов (вагинитах, уретритах и др.), количество белка при этом незначительно – до 0,01 г/л. Почечные протеинурии могут быть функциональными (при переохлаждении, физических нагрузках, лихорадке) и органическими — при гломерулонефрите, пиелонефрите, нефрите, нефрозах, почечной недостаточности. При почечных протеинуриях содержание белка может быть от 0,033 до 10 – 15 г/л, иногда выше.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка.

Обнаружение белка в моче с 20% сульфосалициловой кислотой.

Реактивы: 20% р-р сульфосалициловой кислоты. Оборудование: темный фон.

1. Требования к моче: моча должна быть кислой (или слабокислой) рН, должна быть прозрачной, для этого мочу центрифугируют. Щелочную мочу подкисляют до слабокислой реакции среды, используя для контроля индикаторную бумагу.

2. В 2 пробирки одинакового диаметра наливают по 2 мл подготовленной мочи. 1 пробирка – контроль, 2 – опыт. В опытную пробирку добавляют 4 капли 20% сульфосалициловой кислоты.

3. Результат отмечают на темном фоне.

4. При наличии белка, моча в опытной пробирке мутнеет.

Качественное определение белка в моче тест – полосками.

Для выявления протеинурий используют различные монотест – полоски: Альбуфан, Альбустикс, Биофан Е и политесты: Трискан, Нонафан и др.

Обнаружение белка в моче по методу Робертса – Стольникова.

Принцип метода: основан на том, что белок под действием неорганических кислот коагулирует (становится видимым). Степень помутнения зависит от количества белка (т.е. кольцевая проба Геллера). При концентрации белка в моче 0,033 г/л к концу 3 минуты после наслаивания мочи появляется тонкое нитевидное белое кольцо.

Реактивы: 50% р-р азотной кислоты или реактив Робертса (98 частей насыщенного раствора поваренной соли и 2 части концентрированной соляной кислоты) или реактив Ларионовой (98 частей насыщенного р-ра поваренной соли и 2 части концентрированной азотной кислоты).

2. В пробирку наливают 2 мл 50% р-ра азотной кислоты или один из реактивов, затем осторожно по стенке пробирки с помощью пипетки наслаивают такой же объем подготовленной мочи

3. Пробу оставляют на 3 минуты

4. Через 3 минуты отчитывают результат. Результат отмечают на темном фоне в проходящем свете. Если кольцо широкое, компактное, то мочу разводят дистиллированной водой и вновь наслаивают на реактив.

5. Мочу разводят до тех пор, пока через 3 минуты не образуется тонкое нитевидное кольцо.

6. Расчет содержания белка в моче производят по формуле:

С = 0,033г/л х степень разведения.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

В состав рабочего места по определению белка в моче входят следующие элементы:

Пробирки химические, агглютинационные.
Набор градуированных пипеток.
Пипетки с узким оттянутым концом.
Спиртовки или газовая горелка.
Черная бумага.
Ледяная уксусная кислота.
Сульфосалициловая кислота.
Концентрированная азотная кислота.
Дистиллированная вода.

Все методики, применяющиеся для качественного определения белка в моче, основаны на свертывании белка. Свертывание белка проявляется выраженным в разной степени помутнением (от опалесценции до большой мутности) или выпадением хлопьев.

Качественное определение белка в моче может быть проведено одним из следующих способов:

кипячением с 10% раствором уксусной кислоты;
реакцией с 20% раствором сульфосалициловой кислоты;
реакцией с 50% раствором азотной кислоты (проба Геллера);
реакцией с 1% раствором азотной кислоты в насыщенном растворе поваренной соли (видоизмененная проба Геллера по Ларионовой).

Перед качественным определением белка в моче проводят следующую подготовительную работу:
1. Мутную мочу фильтруют через бумажный фильтр. Если получить прозрачный фильтрат не удается, производят повторное фильтрование через тот же фильтр или же смешивают мочу с небольшим количеством инфузорной земли или талька, после чего ее фильтруют.
2. Если моча имеет щелочную реакцию, ее подкисляют 10% раствором уксусной кислоты до слабокислой реакции под контролем лакмусовой или универсальной индикаторной бумажки.
3. При малом содержании солей (светло-желтая или бледно-желтая моча с малым удельным весом) к каждой
пробе добавляют несколько капель насыщенного раствора поваренной соли, так как недостаток солей обусловливает свертывание белка.
4. Степень помутнения наблюдают с помощью черного фона. В качестве фона используют черный картон или черную бумагу, применяемую в фотографии. Учет реакции на черном фоне позволяет выявить малейшую степень помутнения.

В отдельном штативе располагают пронумерованные пробирки. В них производят одну из описанных ниже реакций.

1. Проба кипячением с 10% раствором уксусной кислоты. Для постановки этой пробы необходим 10% раствор уксусной кислоты, который готовят следующим образом: 10 мл ледяной уксусной кислоты помещают в цилиндр и доливают дистиллированной водой до метки 100 мл.

Техника определения белка. В химическую пробирку помещают 10—12 мл отфильтрованной мочи слабокислой реакции. Затем верхнюю часть пробирки с мочой осторожно нагревают до кипения и добавляют в нее 8—10 капель 10% раствора уксусной кислоты. Пробирку с мочой рассматривают на черном фоне в проходящем свете. При наличии белка в моче появляется мутность разной степени (от опалесценции до большой мутности) или выпадают хлопья. Контролем служит нижняя часть пробирки, не подвергавшаяся нагреванию. Этой пробой обнаруживают количество белка, начиная с 0,015%о (%о — promille).

2. Реакция с 20% раствором сульфосалициловой кислоты. 20 % раствор сульфосалициловой кислоты готовят следующим образом: 20 г сульфосалициловой кислоты растворяют в 70-80 мл дистиллированной воды, переводят в цилиндр емкостью 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки. Приготовленный реактив хранят в посуде из темного стекла.

Техника определения белка. В две пробирки одинакового диаметра помещают по 2—3 мл отфильтрованной мочи слабокислой реакции, в одну из пробирок к моче прибавляют 3—4 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты, другая пробирка служит контролем. При наличии белка в пробирке с реактивом появляется мутность или выпадают хлопья свернувшегося белка. В контрольной пробирке жидкость остается прозрачной. Сульфосалициловая кислота наряду с белком сыворотки осаждает альбумозы (пептиды), представляющие собой продукт распада белка. С целью уточнения причины помутнения мочи пробирку с мочой подогревают. Мутность, причиной образования которой оказались сывороточные белки, усиливается, мутность же, обусловленная присутствием альбумоз, исчезает. Эта проба имеет ту же чувствительность, что и предыдущая.

3. Реакция с 50 % раствором азотной кислоты (проба Геллера). 50% раствор азотной кислоты готовят следующим образом: к 50 мл азотной кислоты удельного веса 1,2-1,4 приливают 50 мл дистиллированной воды (разведение 1:1).

Техника определения белка. В узкую небольшую пробирку (тина агглютинационной) наливают 1 мл 50% азотной кислоты. В пипетку с узким оттянутым концом набирают 1 мл отфильтрованной исследуемой мочи, наслаивают на реактив и пробирку переводят в вертикальное положение. При наличии белка на границе жидкостей появляется белое кольцо. Время появления кольца, его свойства зависят от количества белка: если белка мало, то кольцо появляется не сразу, поэтому за его появлением следят в течение 2,5-3 минут. Минимальное количество белка, определяемое этим методом, 0,033°/оо. При меньшем содержании белка в моче кольцо не образуется. Учет результатов реакции производят на черном фоне в проходящем свете.

4. Реакция с 1% раствором азотной кислоты на насыщенном растворе поваренной соли — видоизмененная проба Геллера (по Ларионовой). Для проведения пробы используют 1 % раствор азотной кислоты, приготовленный на насыщенном растворе поваренной соли (реактив Ларионовой). 35 г поваренной соли растворяют в 100 мл дистиллированной поды, раствор фильтруют, к 1 мл концентрированной азотной кислоты удельного веса 1,2-1,4 приливают 99 мл приготовленного насыщенного раствора поваренной соли.

Техника определения белка такая же, как и при реакции с 50% раствором азотной кислоты (проба Геллера), но вместо 1 мл 50% раствора азотной кислоты в пробирку наливают 1 мл реактива Ларионовой и на него наслаивают 1 мл мочи. Появление белого кольца на границе жидкостей указывает на наличие белка в исследуемой моче. Проба по Ларионовой так же чувствительна, как и проба Геллера.

5. Колориметрическая (сухая) проба качественного определения белка. Колориметрическая (сухая) проба качественного определения белка в моче основана на воздействии, которое оказывает белок на цвет индикатора в буферном растворе.

Техника определения белка. Кусочек индикаторной бумаги, предназначенный для определения белка погружают в мочу на короткое время. Пробу считают положительной, если бумажка окрашивается в сине-зеленый цвет.

Количественное определение белка в моче основано на том, что при наслаивании мочи, содержащей белок, на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой на границе двух жидкостей образуется белое кольцо, причем если четкое белое кольцо появляется к 3 минутам, то содержание белка равно 0,033%о или 33 мг в 1000 мл мочи. Появление кольца ранее 3 минут свидетельствует о большем содержании белка в моче.
При количественном определении белка в моче выполняют следующие правила:

Количественное определение белка производят только в тех порциях мочи, где он был обнаружен качественно.
Определение производят с тщательно отфильтрованной мочой.
Точно соблюдают технику наслаивания исследуемой мочи на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой в соотношении реактива с мочой (1:1).
Время появления кольца определяют по секундомеру: при окончательном расчете количества белка учитывают время наслаивания мочи на азотную кислоту, которое равно 15 секундам.
Разведение мочи производят исходя из свойства кольца. При этом каждое последующее разведение мочи готовят из предыдущего.
Определение колец производят на черном фоне.

Наиболее распространены два метода количественно¬го определения белка в моче: метод Робертса — Стольникова — Брандберга и метод С. Л. Эрлиха и А. Я. Альтгаузена.

Метод Робертса-Стольникова-Брандберга. По этому способу количество белка в моче определяют путем разведения ее до тех пор, пока при очередном наслаивании мочи на 50% раствор азотной кислоты или реактив Ларионовой кольцо появится точно к 3 минутам. Расчет количества белка производят, умножая 0,033%о на степень разведения мочи. Полученный результат выражает количество белка в миллиграммах на 1000 мл мочи, т. е. в promille (%о).
Метод С. Л. Эрлиха и А. Я. Альтгаузена. В штатив помещают ряд агглютинационных пробирок, в которые предварительно наливают по 1 мл 50% раствора азотной кислоты или реактива Ларионовой. Исследуемую мочу берут отдельной чистой, сухой пипеткой с узким оттянутым концом и наслаивают на реактив, после чего включают секундомер. За временем появления кольца следят, располагая пробирку на черном фоне. При появлении кольца секундомер выключают.

При наслаивании мочи в зависимости от количества белка может появиться компактное, широкое или нитевидное кольцо. Компактное, широкое кольцо появляется тотчас же после наслаивания мочи на реактив. Нитевидное кольцо может появиться сразу, до истечения одной минуты, или в промежутке от одной до 4 минут.

При появлении нитевидного кольца в пределах от одной до 4 минут производить разведение мочи не нужно!
Для вычисления количества белка в этом случае достачно использовать предложенную авторами таблицу-план (табл. 1).

Пример 1. При наслаивании мочи на реактив нитевидное кольцо образовалось через 2 минуты. Если бы кольцо образовалось к 3 минутам, то количество белка было было бы равно 0,033%о.

В данном же случае кольцо образовалось раньше. Соответственная поправка, согласно таблице-плану, для времени в 2 минуты равна 1+1/8. Это значит, что белка в данной порции мочи будет в 1+1/8 раза больше, чем 0,033°/оо, т. е. 0,033%о X(1+1/8) = 0,037°/оо.

При появлении нитевидного кольца до 1 минуты, т. е. через 40-60 секунд, производят одно разведение мочи в 1,5 раза (2 части мочи + 1 часть воды), а затем вновь наслаивают разведенную мочу на реактив и регистрируют появление кольца. При расчете результатов учитывают, что моча была разведена в 1,5 раза.

Пример 2. После наслаивания разведенной в 1,5 раза мочи нитевидное кольцо появилось к 2 минутам. Если бы кольцо появилось к 3 минутам, то белка было бы 0,033%. Соответственная поправка согласно таблице-плану, для времени в 2 минуты равна 1+1/8. Белка в моче содержится 0,033%оX1,5X(1+1/8) = 0,056%о.

Если нитевидное кольцо появляется сразу, мочу разводят в 2 раза (1 часть мочи + 1 часть воды). Разведенную мочу вновь наслаивают на реактив и отмечают появление кольца по истечении 1 минуты.

Пример 3. При наслаивании разведенной в 2 раза мочи на реактив нитевидное кольцо появилось через 1 минуту 15 секунд. Тогда количество белка в исследуемой моче по аналогии с прежними расчетами будет равно
0,033%оХ2Х(1+3/8) = 0,091%.
В случае появления широкого кольца мочу разводят в 4 раза (1 часть мочи + 3 части воды).
При последующем наслаивании разведенной мочи нитевидное кольцо может образоваться как до, так и по истечении одной минуты. В таких случаях расчет количества белка производят по аналогии с предыдущими примерами, т. е. 0,033% о умножают на степень разведения и на соответственную поправку.

Пример 1. Кольцо после разведения мочи в 4 раза появилось сразу же. Мочу разводят в 2 раза. После наслаивания мочи, разведенной в 8 раз (4X2), нитевидное кольцо образовалось через 1,5 минуты. В таком случае количество белка равно 0,033%оХ8X1,25 = 0,33%о и т. д.
При появлении компактного кольца мочу разводят в 8 раз (1 часть мочи+ 7 частей воды). При последующем наслаивании разведенной мочи на реактив может образоваться либо компактное, либо широкое, либо нитевидное кольцо.

Пример 2. При наслаивании мочи на азотную кислоту тотчас же образовалось компактное кольцо. Мочу разводят в 8 раз (1 часть мочи + 7 частей воды) и вновь производят ее наслаивание. При этом опять получилось компактное кольцо. Тогда мочу разводят еще в 8 раз (для этого в цилиндр или в пробирку берут 1 часть разведенной мочи и прибавляют к ней 7 частей воды). После очередного наслаивания разведенной мочи нитевидное кольцо образовалось сразу. Мочу разводят в 2 раза (1 часть мочи + 1 часть воды). После очередного наслаивания разведенной мочи нитевидное кольцо образовалось к 2 минутам. Расчет количества белка данной порции мочи производят так: 0,033,%оX8X8X2X(1+1/8) = 4,8%о.

Помимо таблицы-плана, имеется таблица с рассчитанными цифрами белка (табл. 2). Если моча не разведена, то количество белка отыскивают в графе «Цельная неразведенная моча». При разведении мочи в целое число раз (8,4,2) используют табл. 1. При разведении мочи в 1,5 раза используют табл. 2.

В соответствующих графах таблицы наводят время появления кольца и степень разведения мочи.
Цифра, находящаяся в точке пересечения горизонтальной и вертикальной линий, проведенных от этих двух показателей, указывает на количество белка в исследуемой моче (%о).

Возможно, что при положительной качественной пробе на белок кольцо при наслаивании на 50% раствор азотной кислоты не образуется. Это значит, что в моче белка меньше 0,033%о. В таких случаях количество белка в бланке анализа обозначают термином «следы».

Если белок определен количественно, в бланке анализа мочи отмечают содержание белка в promille, например «белок — 0,66%о».

Помимо количественного определения белка в отдельной порции мочи, рассчитывают суточное его количество в граммах. С этой целью собирают суточную мочу, измеряют ее количество и определяют содержание белка в promille. Затем производят расчет. Например, суточное количество мочи равно 1800 мл, белок — 7°/оо. Значит, белка в суточном количестве мочи содержится: 1,8X7 = 12,6 г.

источник

Западно-Казахстанский Высший медицинский колледж. Сайт преподавателя МКЛИ Байбулатовой Светланы Андреевны

Химическое исследование мочи включает в себя определение белка, глюкозы, ацетона и ацетоуксусной кислоты, желчных пигментов и уробилиноидов и некоторых других ингредиентов.

Важным условием химического исследования мочи, особенно определения белка, является ее прозрачность.

Прежде чем приступить к исследованию, необходимо провести центрифугирование мочи: 10,0 мл. мочи вносят в центрифужную пробирку. Пробирку ставят в центрифугу. Включают прибор на 10 минут соблюдая все необходимые правила безопасной работы с центрифугой. Необходимо помнить, что центрифуга включается тогда, когда в приборе находится только чётное количество центрифужных пробирок.

В моче здорового человека белок не выявляется, поскольку те методы, которые используются обычно в клинике (проба с сульфосалициловой кислотой и биуретовая реакция) не позволяют обнаружить небольшие количества низкомолекулярных сывороточных протеинов (около 10–50 мг в сутки), которые и в норме проникают через неповрежденный почечный барьер.

Для обнаружения белка в моче (протеинурии) используют качественные и количественные методы, большинство из которых основаны на его свертывании или осаждении специальными реактивами.

Проба с сульфосалициловой кислотой.

В 2 пробирки наливают по 3–4 мл профильтрованной мочи.

В опытную пробирку добавляют 6–8 капель 20% раствора сульфосалициловой кислоты.

На темном фоне в проходящем свете сравнивают обе пробирки.

При наличии белка в зависимости от его количества образуется помутнение или выпадают хлопья свернувшегося белка (рис. 1, а).

Результаты обозначают следующим образом: реакция слабоположительная (+), положительная (++), резко положительная (+++).

Проба с азотной кислотой (кольцевая проба Геллера).

В пробирку наливают 1–2 мл 30% азотной кислоты или реактива Ларионовой (1% раствор азотной кислоты в насыщенном растворе натрия хлорида) и осторожно по стенке наслаивают сверху такое же количество мочи.

При наличии белка через 2–3 мин (или раньше) на границе двух сред (кислоты и мочи) образуется тонкое белое кольцо свернувшегося белка (рис. 1, б).

Проба становится положительной даже при минимальной концентрации белка в моче — 0,033 г/л (0,033 о /_оо).

Следует, правда, помнить, что беловатое или красновато-фиолетовое кольцо при проведении этой пробы, располагающееся несколько выше границы между двумя жидкостями, может образовываться при наличии в моче большого количества уратов.

Однако уратное кольцо в отличие от белкового при легком нагревании растворяется.

Схема качественного определения белка в моче с помощью проб с сульфасалициловой кислотой (а) и азотной кислотой (б).

На рис. 1, б стрелкой показано белое кольцо преципитации белка

Метод разведения Брандберга-Робертса-Стольникова

Метод основан на количественной оценке результатов пробы с азотной кислотой (кольцевой пробы Геллера — см. выше).

Ход определения белка такой же, как и при этой качественной реакции.

Считается, что появление тонкого белого кольца на границе азотной кислоты и мочи (рис. 1, б) на 2–3-й минуте указывает на наличие белка в моче в концентрации 0,033 г/л.

Если кольцо появляется раньше 2 мин, мочу разводят в 2 раза и снова повторяют исследование.

Если и на этот раз кольцо появляется раньше 2 мин, мочу снова разводят в 2, 4, 8 и т. д. раз, пока тонкое белое кольцо не появится на 2–3-й минуте.

Искомую концентрацию белка в моче вычисяют, умножая 0,033 г/л на степень разведения.

Метод основан на возникновении помутнения мочи при коагуляции белка сульфосалициловой кислотой.

Интенсивность помутнения пропорциональна концентрации белка.

В градуированную пробирку вносят 1,25 мл профильтрованной мочи, добавляют до 5 мл 3% раствор сульфосалициловой кислоты и перемешивают.

Через 5 минут измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 590–650 нм против контроля в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Метод основан на свойстве белка давать с сернокислой медью и едкой щелочью так называемый биуретовый комплекс фиолетового цвета.

Интенсивность окраски, количественно определяемая на фотоэлектроколориметре, пропорциональна концентрации белка.

Определение суточной протеинурии.

При заболеваниях почек, сопровождающихся протеинурией, уровень выделения белка с мочой в течение суток колеблется в широких пределах.

Поэтому в клинической практике выраженность протеинурии принято оценивать по суточной потере белка с мочой (суточной протеинурии).

В 8 ч утра пациент мочится в унитаз, после чего всю выделенную в течение суток (до 8 ч следующего дня) мочу собирают в отдельную емкость объемом 3 литра.

Затем измеряют общее количество мочи, тщательно размешивают ее и наливают в отдельную банку емкостью 150–200 мл.

В этой порции мочи определяют концентрацию белка по одному из методов, описанных выше.

Суточную протеинурию (в граммах) рассчитывают по формуле:

где Р_с— суточная протеинурия (в граммах); Р — концентрация белка в суточной моче (г/л); V — суточный диурез.

У здорового человека в разовой порции мочи при использовании перечисленных выше методов белок не определяется.

Выделение белка с мочой (протеинурия) имеет важное диагностическое значение.

Даже следы белка (0,033 г/л), обнаруженные в разовой порции мочи, требуют уточнения причин протеинурии.

1. преренальную протеинурию, обусловленную усилением распада белка тканей (опухоли, ожоги, массивный гемолиз эритроцитов и т. п.);

2. ренальную протеинурию, связанную с патологией почек;

3. постренальную протеинурию, вызванную патологией мочевыводящих путей, и чаще всего связанную с воспалительной экссудацией (заболевания мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, половых органов).

В практическом отношении важно отличать ренальную и постренальную формы протеинурии.

Постренальная форма протеинурии сопровождается появлением в моче большого количества лейкоцитов или эритроцитов.

При ренальной форме протеинурии в моче обычно присутствуют цилиндры.

Почечная (ренальная) протеинурия обусловлена повышением проницаемости клубочкового фильтра и уменьшением реабсорбции профильтровавшегося белка в почечных канальцах.

Различают функциональную (физиологическую, доброкачественную) и патологическую (органическую) почечную протеинурию.

Функциональная почечная протеинурия

Функциональная почечная протеинурия обусловлена временным преходящим увеличением фильтрации белков сыворотки крови в ответ на сильные внешние раздражения (необычные статические и динамические нагрузки, повышенная мышечная работа, лихорадка, интоксикация) и не связана с поражением почек и мочевыводящих путей.

Функциональная протеинурия вызвана замедлением почечного кровообращения или преходящим нарушением проницаемости клубочковых капилляров в результате вторичного токсико-инфекционного поражения (О. Шюк).

Следует помнить о нескольких наиболее распространенных вариантах функциональной почечной протеинурии:

1. Ортостатическая (юношеская) протеинурия выявляется у здоровых молодых лиц астенического телосложения с лордозом поясничного отдела позвоночника.

Она появляется при длительном нахождении в вертикальном положении и исчезает в горизонтальном положении.

2. Рабочая (маршевая) протеинурия, появляющаяся после тяжелой физической нагрузки.

3. Лихорадочная протеинурия, возникающая при различных заболеваниях, сопровождающихся повышением температуры тела.

Такая протеинурия исчезает после нормализации температуры.

4. Алиментарная протеинурия (после обильной белковой пищи).

5. Пальпаторная протеинурия (после продолжительной пальпации почек).

6. Эмоциональная протеинурия — при значительном психоэмоциональном напряжении.

Функциональная почечная протеинурия, как правило, не превышает 1,0 г/л и исчезает после устранения причин, ее вызвавших.

Во всех случаях обнаружения белка в моче необходимо тщательное обследование больного для исключения органических заболеваний почек, сопровождающихся патологической протеинурией.

Патологическая почечная протеинурия является одним из наиболее важных признаков органического поражения клубочкового аппарата и почечных канальцев.

Наиболее частыми причинами патологической почечной протеинурии являются:

1. острый и хронический гломерулонефрит;

2. острый и хронический пиелонефрит;

4. застойная недостаточность крвообращения;

7. гипертоническая болезнь;

8. системные заболевания соединительной ткани с поражением почек;

9. геморрагический васкулит;

11. анафилактический шок и другие причины.

Особенно значительной протеинурия бывает при нефротическом синдроме.

При нефротическом синдроме концентрация белка в моче достигает 3–10 г/л.

У больных с заболеваниями почек протеинурия усиливается при:

1) выполнении физической нагрузки;

2) длительном нахождении в вертикальном положении;

Селективность протеинурии — это способность клубочкового фильтра пропускать молекулы белка плазмы в зависимости от его молекулярной массы.

При умеренном повреждении фильтрующей мембраны в моче преобладают низкомолекулярные белки (альбумины), тогда как белки с большой молекулярной массой (глобулины и др.) составляют небольшое количество. В этих случаях говорят о высокой селективности (избирательности) протеинурии.

Наоборот, при тяжелых поражениях почек селективность протеинурии снижается, и в моче появляются крупномолекулярные белки (например g-глобулины. В этих случаях качественный состав белков мочи приближается к белковому составу плазмы.

Таким образом, низкая селективность протеинурии свидетельствует о более тяжелом поражении клубочковых капилляров.

В моче здорового человека глюкоза отсутствует, за исключением тех редких случаев, когда преходящая, кратковременная и незначительная глюкозурия вызвана избыточным употреблением в пищу простых углеводов или внутривенным введением концентрированного раствора глюкозы.

Во всех остальных случаях глюкозурию следует расценивать как явление патологическое.

Патологическая глюкозурия может быть обусловлена:

1. превышением определенного критического уровня глюкозы в крови (примерно 8,8–9,9 ммоль/л) в связи с ограниченной способностью канальцев почек реабсорбировать глюкозу;

2. увеличением фильтрации глюкозы в клубочках почек вследствие их повреждения;

3. снижением реабсорбции глюкозы в проксимальных отделах почечных канальцев за счет первичного или вторичного их повреждения.

Глюкозурия может выявляться как при повышенном, так и при нормальном уровне глюкозы в крови.

Существуют качественные и количественные способы выявления (определения) глюкозы в моче.

Проба Гайнеса основана на способности глюкозы при нагревании в щелочной среде восстанавливать гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета) и закись меди (красного цвета).

Для проведения реакции в пробирку наливают 4 мл реактива Гайнеса (смесь растворов сернокислой меди, едкого натра и глицерина), добавляют к нему 8–12 капель мочи и нагревают верхнюю часть пробирки на пламени горелки до кипения (нижняя часть пробирки служит своеобразным контролем) (рис. 2).

При наличии в моче глюкозы в верхней части пробирки появляется желтая или красная окраска жидкости, а в нижней части — осадок коричнево-зеленоватого цвета.

Рисунок 2. Схема качественного определения глюкозы в моче (проба Гайнеса)

Определение глюкозы с помощью индикаторных полосок.

Метод основан на окислении глюкозы специфическим ферментом глюкозооксидазой с образованием перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы разлагается и окисляет специальный краситель.

Бумажные полоски, пропитанные глюкозооксидазой, пероксидазой и красителем опускают в пробирку с мочой, сразу вынимают и оставляют на 2 минуты на пластмассовой пластинке.

При наличии в моче глюкозы полоски окрашиваются в синий цвет, интенсивность которого соответствует концентрации глюкозы.

Сравнивая окраску с прилагаемой к набору стандартной цветовой шкалой можно ориентировочно определить содержание глюкозы в моче.

Глюкозооксидазный метод, принцип которого описан выше, дает более точные результаты определения концентрации глюкозы в моче.

В результате реакции образуется окрашенное вещество, интенсивность окраски колориметрируют и по калибровочной кривой, построенной на основании определений стандартных растворов глюкозы, рассчитывают ее содержание в моче.

Кетоновые тела (ацетон, ацетоуксусная и b-оксимасляная кислоты) являются промежуточными продуктами углеводного и жирового обмена. В норме, образуясь в небольшом количестве из ацетил-КоА, они почти полностью утилизируются в цикле трикарбоновых кислот (цикле Кребса).

При сахарном диабете и голодании усиливается утилизация жиров с образованием большого количества ацетил-КоА, который вследствие нарушений углеводного обмена не утилизируется и не используется в цикле трикарбоновых кислот.

В результате увеличивается содержание кетоновых тел, которые выделяются с мочой.

Кетоновые тела обладают выраженным токсическим действием на ЦНС .

Поэтому определение кетоновых тел в моче имеет важное диагностическое значение.

Проба основана на свойстве натрия нитропруссида реагировать в щелочной среде с кетоновыми телами с образованием комплексных соединений, окрашенных в красно-фиолетовый цвет.

В пробирку с 3–5 мл мочи добавляют 5–10 капель свежеприготовленного 10% раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл концентрированной уксусной кислоты и смешивают их.

После этого осторожно по стенке пробирки наслаивают 2–3 мл 25% раствора аммиака.

Если в течение 3 минут на границе двух жидкостей получается красно-фиолетовое кольцо, пробу считают положительной (рис. 3).

Рисунок 3. Схема качественного определения кетоновых тел в моче (проба Ланге). Красной стрелкой показано красно-фиолетовое кольцо, появляющееся на границе мочи и раствора аммиака

Проба основана на том же принципе образования окрашенных соединений, что и проба Ланге.

В пробирке смешивают 200 мг сухого аммония сульфата, 5 капель мочи и 2 капли раствора натрия нитропруссида.

На эту смесь осторожно наслаивают 10–15 капель водного раствора аммиака.

Фиолетово-красное кольцо на границе двух сред свидетельствует о наличии в моче кетоновых тел.

Причем интенсивность окраски кольца пропорциональна концентрации кетоновых тел в моче.

В клинической практике получили распространение также различные модификации экспресс-анализа кетоновых тел в моче, например с помощью таблеток или полосок бумаги, содержащих все необходимые для реакции компоненты.

На таблетку наносят 2 капли мочи и через определенное время, указанное в инструкции, сравнивают интенсивность фиолетового окрашивания с цветной шкалой, соответствующей различной концентрации кетоновых тел в моче.

В норме методами, описанными выше, кетоновые тела не обнаруживаются.

Наиболее частыми причинами кетонурии являются:

1. диабетический кетоацидоз;

2. длительное голодание (так называемая кетонемическая гипогликемия);

4. несбалансированное безуглеводное питание (строгое ограничение углеводов при нормальном потреблении жиров);

5. состояния, связанные с повышенным метаболизмом (высокая лихорадка, тяжелый тиреотоксикоз и др.).

У здорового человека методами, используемыми в клинике, билирубин в моче не обнаруживается.

Появление билирубина в моче (билирубинурия) — всегда явление патологическое.

Оно связано с проникновением через почечный барьер связанного (прямого) билирубина (билирубин-глюкуронида).

Несвязанный (непрямой) билирубин не проходит через неповрежденный почечный фильтр, так как адсорбирован белком (альбумином).

В клинической практике широко применяются качественные пробы на билирубин.

Большинство из них основаны на его окислении йодом или азотной кислотой с образованием биливердина, окрашенного в зеленый цвет.

Йодная проба (проба Розина).

В качестве окислителя используется раствор Люголя или 1% спиртовой раствор йода. В пробирку с 3–4 мл мочи осторожно по стенке наслаивают 1–2 мл 1% спиртового раствора йода или раствора Люголя.

При наличии билирубина в моче на границе между двумя жидкостями образуется зеленое кольцо.

Билирубинурия выявляется при двух видах желтух (паренхиматозной и обтурационной).

Определение уробилина в моче

Уробилиновые тела (уробилиноиды) являются промежуточными продуктами пигментного обмена.

Они представлены, главным образом, уробилиногеном (мезобилиногеном) и стеркобилиногеном.

В норме уробилиноиды в моче представлены следами стеркобилиногена (около 4 -6 мг/с) и не обнаруживаются обычными качественными пробами.

Проба с сульфатом меди (проба Богомолова)

Проба основана на взаимодействии уробилина с сульфатом меди, что приводит к образованию соединений, окрашенных в красновато-розовый цвет.

К 10–15 мл мочи приливают 2–3 мл насыщенного раствора сульфата меди.

При помутнении раствора в него добавляют несколько капель концентрированной соляной кислоты, через 5 мин добавляют 2–3 мл хлороформа, закрывают пробирку и встряхивают ее.

Если хлороформ окрашивается в розовый цвет, то концентрация уробилина в моче превышает норму.

Чувствительная проба для выявления уробилиноидов.

При взаимодействии уробилина и соляной кислоты образуется соединение, окрашенное в красновато-розовый цвет.

К 10 мл мочи добавляют 3–4 капли концентрированной серной кислоты, смешивают, приливают 2–3 мл эфира и, плотно закрыв пробирку пробкой, осторожно смешивают, не взбалтывая.

В другую пробирку наливают 2 мл концентрированной соляной кислоты.

Пипеткой отсасывают из первой пробирки эфирную вытяжку и наслаивают ее на соляную кислоту.

На границе двух жидкостей при наличии уробилина образуется розовое кольцо, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации уробилина.

В норме описанными выше способами уробилин в моче не определяется, хотя иногда при проведении достаточно чувствительной пробы Флоренса на границе между двумя жидкостями можно заметить легкое розовое окрашивание.

Выделение уробилиноидов с мочой обнаруживают при следующих патологических заболеваниях и синдромах:

1. при паренхиматозной желтухе (преимущественно за счет мезобилиногена, не разрушающегося в печени);

2. при гемолитической желтухе (преимущественно за счет стеркобилиногена, в существенно большем количестве образующегося при усиленном распаде эритроцитов);

3. при заболеваниях кишечника, сопровождающихся усиленной реабсорбцией стеркобилиногена в кишечнике (энтероколиты, запоры, кишечная непроходимость).

источник

Для клиники имеет значение как качественное, так и количественное определение белка в моче.

Качественные пробы определения белка в моче
Предложено более 100 реакций качественного определения белка в моче. Большинство из них основаны на осаждении белка физическими (нагреванием) или химическими средствами. Наличие белка доказывается появлением мути.

Представляют интерес также и колориметрические сухие пробы.

Ниже будут описаны только наиболее важные для практики пробы.

Проба с сульфосалициловой кислотой. К нескольким миллилитрам мочи прибавляют 2-4 капли 20% раствора сульфосалициловой кислоты. При положительной реакции появляется муть. Результат обозначают терминами: опалесценция, слабо положительная, положительная или сильно положительная реакция. Проба с сульфосалициловой кислотой одна из самых чувствительных проб для установления белка в моче. Ею обнаруживаются даже самые незначительные патологические увеличения белка в моче. Благодаря простой технике эта проба нашла широкое применение.

Проба с асептолом. Асептол является заместителем сульфосалициловой кислоты. Его можно приготовить из имеющихся в любой лаборатории материалов (фенола и серной кислоты). В качестве реактива употребляют 20% раствор асептола. Проба проводится следующим образом: в пробирку, содержащую 2-3 мл мочи, подслаивают на дно 0,5-1 мл раствора асептола. Если на границе между двумя жидкостями получится белое кольцо из свернувшегося белка, проба положительна.

Проба Геллера. Под несколько миллилитров мочи подслаивают 1-2 мл 30% азотной кислоты (уд. вес 1,20). Если на границе обеих жидкостей получится белое кольцо, проба положительна. Реакция становится положительной, если белка больше 3,3 мг%. Иногда белое кольцо получается при наличии больших количеств уратов. В отличие от белкового кольца, уратное кольцо появляется не на границе между обеими жидкостями, а немного выше. Ларионова предлагает вместо 30% азотной кислоты употреблять в качестве реактива 1% раствор азотной кислоты в насыщенном растворе поваренной соли; это дает большую экономию азотной кислоты.

Проба с железистосинеродистым калием и уксусной кислотой. Эта реакция дает возможность отграничить белки сыворотки от нуклеоальбуминов.

В две пробирки наливают равные количества мочи. В одну из них добавляют несколько капель 30% раствора уксусной кислоты. Если получится муть по сравнению с контрольной пробиркой, моча содержит нуклеоальбумин. Если муть не появится, содержимое обеих пробирок смешивают и вновь разделяют на две части. В одну из двух пробирок добавляют несколько капель (избыток может превратить положительную пробу в отрицательную) 10% раствора желтой кровяной соли (железистосинеродистого калия). При наличии протеинов сыворотки получается муть.

При концентрированной моче, содержащей большие количества мочевой кислоты и уратов, пробу с железистосинеродистым калием и уксусной кислотой следует производить после предварительного разведения (в 2-3 раза) мочи водой. В противном случае может наступить помутнение, вызванное осевшей мочевой кислотой.

Это имеет особенно важное значение при исследование мочи грудных детей, содержащей много мочевой кислоты и уратов.

Из остальных качественных проб на белок в моче, основанных на осаждении белков, применение нашли: проба кипячением, пробы Эсбаха, Пэрди, Робертса, Альмена, Баллони, Буро, Клаудиуса, Корсо, Домэ, Гудманна-Сюзанна, Жолле, Экстона, Камлета, Кобуладзе, Лилиендаля-Петерсена, Полаччи, Понса, Шпиглера, Танре, Тиле, Броуна, Цушия и др.

При производстве качественных проб на белок в моче, основанных на осаждении белков, необходимо соблюдать следующие общие правила, нарушение которых приводит к значительным ошибкам при исследовании.

1. Исследуемая моча должна иметь кислую реакцию. При щелочной реакции, мочу слегка подкисляют уксусной кислотой. Производство пробы с щелочной мочой в тех случаях, когда используется в качестве реактива кислота, может привести к нейтрализации кислоты и к отрицательному результату при положительной реакции. Это особенно относится к пробе с сульфосалициловой кислотой, т. к. кислота прибавляется в очень малых количествах и легко может быть нейтрализована.

2. Исследуемая моча должна быть прозрачной.

3. Пробы для установления белка в моче следует всегда производить в двух пробирках, одна из которых служит контролем. Без контрольной пробирки можно не заметить легких помутнении при реакциях.

4. Количество прибавляемой кислоты при пробах не должно быть слишком большим. Большое количество кислоты может привести к образованию растворимых ацидальбуминов и к превращению положительной пробы в отрицательную.

Заслуживают большого внимания, благодаря своей простой технике, колориметрические сухие пробы. При этих пробах используется влияние, которое белок оказывает на цвет индикатора в буферном растворе (т. наз. протеиновая ошибка индикаторов). Лента фильтровальной бумаги, пропитанная кислым цитратным буфером и бромфеноловым синим в качестве индикатора, погружается на короткое время в мочу. Проба положительна, если получится сине-зеленая окраска. Сравнивая интенсивность окраски с цветными бумажными стандартами, можно вывести ориентировочно и количественные заключения. Индикаторная бумага продается в пачках с соответственными цветными стандартами, подобно универсальной индикаторной бумаге.

Методы, количественного определения белка в моче
Для количественного определения белка в моче предложено много методов. Точные количественные методы определения белков в биологическом материале не нашли широкого применения при определении белка в моче, вследствие сложной и трудоемкой техники. Широкое распространение получили волюметрические методы, особенно метод Эсбаха. Они очень просты, но, к сожалению, не отличаются большой точностью. Удобны для клиники также и методы группы Брандберга-Стольникова, дающие более точные результаты, чем волюметрические методы, при сравнительно простой технике. При наличии фотометра или нефелометра удобны также нефелометрические методы.

Метод Эсбаха. Он предложен парижским врачом Эсбахом в 1874 г. В специальную пробирку (альбуминометр Эсбаха) наливают мочу и реактив. Пробирку закупоривают резиновой пробкой, тщательно размешивают (не взбивая!) и оставляют в вертикальном положении до следующего дня. Отчитывают деление, до которого доходит столбик белкового осадка. Найденное число показывает содержание белка. Очень важно при методе Эсбаха, чтобы моча была кислой. Щелочная моча может нейтрализовать кислые составные части реактива и воспрепятствовать осаждению белков.

Преимущества метода: он прост и удобен на практике.

Недостатки: метод неточен, результат получается через 24 — 48 часов.

Метод Брандберга-Стольникова. Он основан на качественной пробе Геллера. Проба Геллера может быть использована для количественного определения, т. к. она дает положительный результат при содержании белка выше 3,3 мг%. Это предельная концентрация белка, ниже которой проба становится отрицательной.

Модификация Эрлиха и Альтгаузена. Советские ученые С. Л. Эрлих и А. Я. Альтгаузен модифицировали метод Брандберга-Стольникова, указав возможности упрощения исследования и экономии времени при его производстве.

Первое упрощение связано с временем появления кольца. Определяется точно время его появления, не придерживаясь непременно 2-ой и 3-ей минуты.

Второе упрощение дает возможность установить, какое следует сделать разведение. Авторы доказали, что по виду полученного кольца можно приблизительно установить необходимое разведение. Они различают нитевидное, широкое
и компактное кольцо.

Из нефелометрических методов заслуживает быть отмеченным метод Кингсбэрри и Кларка. В небольшой градуированный цилиндр наливают 2,5 мл фильтрованной мочи, пополняют 3% водным раствором сульфосалициловой кислоты до 10 мл. Тщательно размешивают и через 5 минут фотометрируют в 1 см кюветке, при желтом фильтре, употребляя воду в качестве компенсационной жидкости. При фотометре Пульфриха найденная экстинкция, умноженная на 2,5, дает количество белка в %о. В том случае, когда экстинкционный показатель выше 1,0, моча предварительно разводится в 2 раза, в 4 раза или еще больше.

Для того, чтобы иметь ясное представление о количестве выделенных в моче белков, необходимо определить не только их концентрацию в отдельной порции мочи, но и их общее суточное количество. Для этого собирают мочу больного в продолжение 24 часов, измеряют ее объем в миллилитрах и определяют концентрацию белка в порции суточной мочи в г%. Количество выделенных в моче за 24 часа белков определяется в зависимости от суточного количества мочи в граммах.

Моча человека нормально содержит минимальные количества белка, которые не могут быть установлены обыкновенными качественными пробами исследования белка в моче. Выделение больших количеств белка, при которых обыкновенные качественные пробы на белок в моче становятся положительными — явление ненормальное, называемое протеинурией. Протеинурия бывает физиологической только у новорожденного, в первые 4-10 дней после рождения. Употребляемое обыкновенно название альбуминурия неправильно, т. к. в моче выделяются не только альбумины, но и другие виды белков (глобулины и пр.).

Протеинурию, как диагностический симптом, открыл в 1770 году Котуньо.

Наиболее важные функциональные почечные протеинурии у детей следующие:

1. Физиологическая протеинурия новорожденного. Встречается у большинства новорожденных и не имеет неблагоприятного значения. Объясняется неокрепшим почечным фильтром, повреждением при рождении или потерей жидкостей в первые дни жизни. Физиологическая протеинурия исчезает на 4-10-ый день после рождения (у недоношенных детей позже). Количество белка невелико. Он представляет собой нуклеоальбумин.

Неонатальная альбуминурия, продолжающаяся долгое время, может быть симптомом конгенитального люэса.

2. Инсультные альбуминурии. Они вызываются превышением порога нормальной раздражимости почечного фильтра значительными механическими, термическими, химическими, психическими и другими раздражениями — потерей жидкости у грудных детей (дегидрационная протеинурия), холодным купанием, обильной, богатой белками пищей (алиментарная протеинурия), пальпацией почки (пальпаторная альбуминурия), физическим переутомленном, страхом и т. д.

Инсультные альбуминурии легче появляются у детей в раннем возрасте, чем у детей в старшем возрасте и у взрослых, так как почки грудного и маленького ребенка легче поддаются раздражениям. Дегидрационная альбуминурия (нарушение кормления, гидрелабилитет, токсикозы, поносы, рвоты) особенно часто наблюдается у грудных детей.

Инсультные альбуминурии доброкачественны. Они исчезают сейчас же после устранения вызывающих их причин. В осадке иногда находятся единичные лейкоциты, цилиндры и эритроциты. Белок чаще всего представляет собой нуклеоальбумин.

3. Ортостатическая протеинурия. Это состояние характерно для детей дошкольного и школьного возрастов. Оно возникает на почве вазомоторных нарушений кровоснабжения почки. Типическим для ортостатической альбуминурии (отсюда и ее название) является то, что она появляется только при стоячем положении ребенка, когда позвоночник занимает лордотическое положение. В лежачем положении она исчезает. Выделяется нуклеоальбумин. В сомнительных случаях можно прибегнуть к ортостатическому опыту, который заключается в следующем: вечером, за час до того как лечь, ребенок опоражнивает мочевой пузырь; утром, вставая с постели, он снова выпускает мочу. Эта моча не содержит белка. Затем ребенка ставят на колени в продолжение 15-30 минут с палкой за спиной, между согнутыми локтями обеих рук. Создается положение лордоза, которое приводит к выделению белка, без изменений в осадке.

При ортостатической альбуминурии в сутки может выделяться 8-10 г белка.

Важнейшее клиническое значение между всеми протеинуриями имеют органические почечные протеинурии. Они вызываются органическими заболеваниями почек (нефритами, нефрозами, нефросклерозами). Протеинурия является одним из самых важных и самых известных симптомов органических заболеваний почек.

1. При остром и хроническом гломерулонефрите протеинурия встречается регулярно. Количество белка умеренное, причем не наблюдается параллельности между степенью протеинурии и тяжестью заболевания. Напротив, хронические и более тяжелые нефриты часто протекают с меньшими количествами белка, чем острые. После острого нефрита, иногда в продолжение долгого времени (годами), устанавливаются небольшие количества белка в моче, не имеющие патологического значения («остаточная альбуминурия»). Не следует забывать, что могут встречаться и «нефриты без протеинурии». Иногда белок обнаруживается в одной порции мочи, а в другой его нет. Отношение альбуминов к глобулинам при острых нефритах невысоко, а при хронических нефритах выше.

2. При нефросклерозе количество белков в моче совсем незначительно, часто встречаются формы болезни без белка в моче.

3. Из всех почечных заболеваний нефрозы протекают с наиболее выраженной протеинурией.

4. При инфекционных и токсических состояниях встречаются так называемые лихорадочные и токсические протеинурии. Это острые нефрозы, при которых количество белка невелико. К этой группе относятся и протеинурии при конвульсивных состояниях (судорогах), при гиперфункции щитовидной железы, желтухах, инвагинациях, энтероколитах, ожогах, тяжелых анемиях и т. д. Эти альбуминурии доброкачественны и быстро проходят (транзиторные альбуминурии).

5. При застое крови в почках встречается так называемая застойная альбуминурия, характерная для сердечно больных в стадии декомпенсации. Она встречается также при асцитах и опухолях живота.

При лихорадочных, токсических и застойных альбуминуриях особенно сильно выражена повышенная проницаемость почечного фильтра. По мнению некоторых авторов, многие на этих протеинурии протекают без органического повреждения паренхимы почек.

Внепочечные альбуминурии вызываются обыкновенно белковыми примесями (секрециями, распавшимися клетками), которые выделяются заболевшими мочевыми путями и половыми органами. Чаще встречаются внепочечные альбуминурии вследствие цистопиелитов (пиурии), реже вследствие вульвовагинитов, конкрементов и опухолей мочевых путей.

При внепочечной альбуминурии в осадке находят большое количество лейкоцитов и бактерий. Почечные элементы почти не встречаются. Количество белка невелико. Фильтрованная или центрифугированная моча обыкновенно не дает положительной пробы на белок.

У выздоравливающих от пиелита альбуминурия исчезает после бактериурии и пиурии.

Следует подчеркнуть как характерное явление, что в раннем детском возрасте органические почечные заболевания появляются чрезвычайно редко, поэтому и органические протеинурии также редки. Из них встречаются, главным образом, лихорадочные и токсические. В отличие от органических протеинурии, у детей в раннем возрасте очень сильно распространены инсультные альбуминурии.

У детей старшего возраста органические протеинурии чаще функциональных. Вообще с возрастом функциональные протеинурии встречаются реже, а органические чаще.

Ряд авторов пользуются электрофоретическим методом для исследования белков в моче (уропротеинов). Из полученных электрофореграмм видно, что они имеют тот же качественный состав, как и белки плазмы. Это указывает на то, что белки в моче происходят из плазменных белков.

источник