Номер инновационного патента: 22733
Скачать PDF файл.
Изобретение относится к способам обнаружения ГИНК (гидразида изоникотиновой кислоты), в моче больных туберкулезом, с целью контроля систематичности приема препарата, на поддерживающем этапе ДОТС терапии амбулаторных больных.
Известен способ обнаружения ГИНК по фармакологически активной части молекулы (пиридиновому циклу) с 2,4 динитрохлорбензолом при этом появляется красно-бурое окрашивание усиливающееся или изменяющееся при стоянии. Реакция протекает в спиртовой среде, 2.4 динитрохлорбензол для анализа берется в виде точной навески, при проведении реакции необходимо строгое соблюдение некоторых условий: выпаривание на водяной бане, дополнительное охлаждение, 2-х часовая выдержка при комнатной температуре, к тому же сам реагент является альгицидным средством. Указанные недостатки ограничивают широкое применение данного способа в практике. — аналог /1 /
Учитывая названные выше недостатки, предлагается способ обнаружения ГИНК в моче с использованием доступных, нетоксичных и простых в приготовлении реактивов. Для повышения чувствительности определения способ осуществляется капельным путем.
Задача изобретения — повышение чувствительности, доступности (возможность проведения анализа в сельской местности) и упрощение способа, повышение производительности труда лаборанта — биохимика (проведение капельным путем).
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что пиридиновый цикл, лежащий в основе молекулы ГИНК под действием хлорродана (получаемого из аммония роданида и хлорсодержащего препарата) расщепляется с образованием производного глутаконового альдегида, последний при конденсации с толилметилпиразолоном образует полиметиновый краситель.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом: к 0,5 мл мочи больного (после 12-24 часов приема препарата) прибавляют 3-5 капель 0,1 М кислоты хлороводородной, 1 каплю раствора аммония роданида 5%, 8 капель раствора хлорсодержащего препарата (можно хлорамина Б), затем прибавляют 1 каплю 0,1М раствора натрия гидроксида и 3-5 капель раствора толилметилпиразолона 1%, сразу появляется розово — фиолетовое окрашивание свидетельствующее о наличии терапевтической концентрации препарата в организме больного.
Предлагаемый способ обнаружения ГИНК в моче больных туберкулезом доступен, прост в исполнении, для его осуществления не требуется сложных и дорогостоящих приборов и реактивов, он может быть широко применен в сельской местности, что позволит контролировать ежедневный прием препарата на поддерживающем этапе ДОТС терапии и уменьшит частоту ранних рецидивов и неблагоприятные исходы болезни.
(51) 61 31/4409 (2006.01), 09 23/16 (2006.01), 01 33/50 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Задача изобретения повышение чувствительности,доступности(возможность проведения анализа в сельской местности) и упрощение способа,повышение производительности труда лаборанта — биохимика(проведение капельным путем). Сущность предлагаемого способа заключается в том, что пиридиновый цикл, лежащий в основе молекулы ГИНК под действием хлорродана(получаемого из аммония роданида и хлорсодержащего препарата) расщепляется с образованием производного глутаконового альдегида,последний при конденсации с толилметилпиразолоном образует полиметиновый краситель. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом к 0,5 мл мочи больного (после 12-24 часов приема препарата) прибавляют 3-5 капель 0,1 М кислоты хлороводородной, 1 каплю раствора аммония роданида 5, 8 капель раствора хлорсодержащего препарата (можно хлорамина Б),затем прибавляют 1 каплю 0,1 М раствора натрия гидроксида и 3-5 капель раствора толилметилпиразолона 1, сразу появляется розово- фиолетовое окрашивание свидетельствующее о наличии терапевтической концентрации препарата в организме больного. Предлагаемый способ обнаружения ГИНК в моче больных туберкулезом доступен, прост в исполнении, для его осуществления не требуется сложных и дорогостоящих приборов и реактивов, он может быть широко применен в сельской местности,что позволит контролировать ежедневный прием препарата на поддерживающем этапе ДОТС терапии и уменьшит частоту ранних рецидивов и неблагоприятные исходы болезни.(56) Бейсенбеков А.С., Алиев Применение реакции образования полиметиновых красителей в фармацевтическом анализе. -Алма-Ата, 1986, с. 49(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГИНК В МОЧЕ, ДЛЯ КОНТРОЛИРУЕМОЙ ТЕРАПИИ АМБУЛАТОРНЫХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ(57) Изобретение относится к способам обнаружения ГИНК (гидразида изоникотиновой кислоты), в моче больных туберкулезом, с целью контроля систематичности приема препарата, на поддерживающем этапе ДОТС терапии амбулаторных больных. Известен способ обнаружения ГИНК по фармакологически активной части молекулы(пиридиновому циклу) с 2,4 динитрохлорбензолом при этом появляется красно-бурое окрашивание усиливающееся или изменяющееся при стоянии. Реакция протекает в спиртовой среде, 2.4 динитрохлорбензол для анализа берется в виде точной навески, при проведении реакции необходимо строгое соблюдение некоторых условий выпаривание на водяной бане,дополнительное охлаждение, 2-х часовая выдержка при комнатной температуре, к тому же сам реагент является альгицидным средством. Указанные недостатки ограничивают широкое применение данного способа в практике. — аналог /1 / Учитывая названные выше недостатки,предлагается способ обнаружения ГИНК в моче с использованием доступных, нетоксичных и простых в приготовлении реактивов. Для повышения чувствительности определения способ осуществляется капельным путем. 22733 Изобретение относится к способам обнаружения ГИНК (гидразида изоникотиновой кислоты), в моче больных туберкулезом, с целью контроля систематичности приема препарата,на поддерживающем этапе ДОТС терапии амбулаторных больных. Тенденция роста заболеваемости туберкулезом, отмечаемая во всех странах мира, делает актуальной проблему повышения эффективности его лечения. В практической медицине сегодня используют,главным образом, химиотерапию в соответствии с последними рекомендациями ВОЗ, при которой больным с впервые выявленным туберкулезом на первом этапе лечения (2-3 мес.) назначается до 4 препаратов, среди которых основным является ГИНК. На последующем этапе (продолжительность лечения 6-9 мес.) больные получают ГИНК амбулаторно. Исключительная роль ГИНК в эффективности лечения туберкулеза объясняется его мощной проникающей способностью в мембрану клеток и действием на бактерии,находящиеся внутриклеточно. Адсорбируясь на микробной клетке, он участвует в обмене веществ микробактерий, блокируя, тем самым образование ферментных систем. Терапевтическая концентрация препарата в крови и моче зависит от характера его метаболизма, который определяется главным образом индивидуальными особенностями организма. Поэтому научная группа ВОЗ требует систематического контроля биодоступности препарата определяемой на основании данных о его концентрации в крови и моче. Разработанная ВОЗ программа ДОТС терапии больных туберкулезом проводится в более короткий, чем это было принято раньше курс химиотерапии. Лечение обязательно контролируется и делится на 2 этапа начальный интенсивный курс и более продолжительный поддерживающий, который в отличие от первого проводится преимущественно в амбулаторных условиях. Данная программа отличается высокой эффективностью, но вместе с тем, отмечается, что более 70 больных, начавших лечение не закончив его, выбывают из под наблюдения. Среди данного контингента больных встречаются преимущественно социально-дезориентированные люди и жители сельской местности. Учитывая,изложенное, а также высокий риск неблагоприятных исходов и рецидивов заболевания,поддерживающий курс данному контингенту больных целесообразно проводить в условиях специального санатория или пунктах контролируемой терапии в сельской местности. Проведение контролируемой терапии для данной категории больных по существу представляет собой единственный выход в сложившейся ситуации. Контроль систематичности приема ГИНК может осуществляться обнаружением его в моче. Известен способ обнаружения ГИНК по фармакологически активной части молекулы(пиридиновому циклу) с 2,4 динитрохлорбензолом при этом появляется красно-бурое окрашивание усиливающееся или изменяющееся при стоянии. Реакция протекает в спиртовой среде, 2.4 2 динитрохлорбензол для анализа берется в виде точной навески, при проведении реакции необходимо строгое соблюдение некоторых условий выпаривание на водяной бане,дополнительное охлаждение, 2-х часовая выдержка при комнатной температуре, к тому же сам реагент является альгицидным средством. Указанные недостатки ограничивают широкое применение данного способа в практике. — аналог / 1 /. 1. Государственная фармакопея СССРиздания, с. 378, Издательство Медицина, Москва,1968 г. Недостатками способа являются длительность,трудоемкость и токсичность реагента. Наиболее близким к изобретению является ускоренный метод определения ГИНК в моче с использованием бумаг пропитанных растворами аммония роданида и хлорамина Б 5 и барбитуровой кислотой 5 — прототип /2/. 2. Бейсенбеков А.С., Алиев Применение реакции образования полиметиновых красителей в фармацевтическом анализе. Алма-Ата, 1986, с.49 Способ осуществляют следующим образом к 2-3 мл мочи в пробирке (берут после 12-24 часов приема препарата) прибавляют кислоты хлороводородной до рН 2,0 и помещают бумагу пропитанную аммония роданидом и хлорамином Б,взбалтывают до тех пор, пока вся бумага не пропитается раствором. После этого через 1-2 мин появляется розовое окрашивание, переходящее со временем в синее. Недостатками способа являются трудоемкость(необходимость приготовления бумаг пропитанных хлорамином Б и аммония роданидом и барбитуровой кислотой), длительность определения(необходимо точно установить рН 2.) кислотой хлороводородной низкая чувствительность,обусловленная нестабильностью приготовленных реактивных бумаг, к тому же при приготовлении используется раствор хлорамина Б, который нестоек и его необходимо использовать только свежеприготовленным. Учитывая указанные выше недостатки,предлагается способ обнаружения ГИНК в моче с использованием доступных и простых в приготовлении реактивов. Задача изобретения повышение чувствительности,доступности(возможность проведения анализа в сельской местности) и упрощение способа,повышение производительности труда лаборанта — биохимика(проведение капельным путем). Сущность предлагаемого способа заключается в том, что пиридиновый цикл, лежащий в основе молекулы ГИНК под действием хлорродана(получаемого из аммония роданида и хлорсодержащего препарата) расщепляется с образованием производного глутаконового альдегида,последний при конденсации с толилметилпиразолоном образует полиметиновый краситель. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом к 0,5 мл мочи больного (после 22733 12-24 часов приема препарата) прибавляют 3-5 капель 0,1 М кислоты хлороводородной, 1 каплю раствора аммония роданида 5, 8 капель раствора хлорсодержащего препарата ( можно хлорамина Б),затем прибавляют 1 каплю 0,1 М раствора натрия гидроксида и 3-5 капель раствора толилметилпиразолона 1, сразу появляется розово- фиолетовое окрашивание свидетельствующее о наличии терапевтической концентрации препарата в организме больного. Предлагаемый способ обнаружения ГИНК в моче больных туберкулезом доступен, прост в исполнении, для его осуществления не требуется сложных и дорогостоящих приборов и реактивов, он может быть широко применен в сельской местности,что позволит контролировать ежедневный прием препарата на поддерживающем этапе ДОТС терапии и уменьшит частоту ранних рецидивов и неблагоприятные исходы болезни. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ обнаружения ГИНК в моче, для контроля систематичности приема препарата на поддерживающем этапе ДОТС терапии амбулаторных больных туберкулезом, на основе реакции образования полиметинового красителя,отличающийся тем,что для получения окрашивания используют цветореагент — 1 раствор толилметилпирозолона и способ осуществляют капельным путем.
источник
Принцип метода
Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричнево-красного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза указывает на степень ацетилированпя ГИНК в организме:
Ход определения
Собранную мочу разводят в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки вносят по 1 мл разведенной мочи; в одну из них (для определения общей ГИНК, т. е. суммы свободной и ацетилированной форм препарата) добавляют 1 мл раствора соляной кислоты, а во вторую (для выявления свободной ГИНК) — 1 мл дистиллированной воды.
Первую пробирку закрывают пробкой и ставят на 20 мин на кипящую водяную баню, после чего охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки приливают по 2 мл реактива метаванадата аммония и отмечают разницу в окрашивании исследуемых проб мочи.
Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется специальной ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. В зависимости от активности этого фермента у разных людей их делят на быстрых и медленных «инактиваторов» (ацетиляторов) ГИНК, что имеет значение не только для практической фармакогенетики, но и для рациональной терапии. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата для конкретного больного.
Работа 3. Проба Квика-Пытеля.
Принцип метода
Проба основана на том, что ароматические соединения окисляются в организме до бензойной кислоты, которая в печени путем соединения с гликоколом переходит в гиппуровую кислоту. По количеству выделившейся гиппуровой кислоты после нагрузки бензойнокислым натрием судят о функции печени. Данную пробу применяют только в тех случаях, когда нет изменений функции почек.
При проведении пробы Квика на белых крысах животным подкожно в паховую область вводят 3 мл 5%-го раствора бензойнокислого натрия в физиологическом растворе и 80,1 мг гликокола, растворенного в 3 мл 0,9% раствора хлористого натрия. Затем их помещают в обменные клетки на 18 часов; в течение которых собирают мочу.
В мочу крысы добавляют сернокислый аммоний (0,5 г на 1,0 мл), после растворения которого мочу отфильтровывают. На фильтре обычно остается осадок. В отфильтрованную мочу добавляют крепкую соляную кислоту (1-2 мл) до покраснения красной бумаги Конго. Пробу оставляют стоять для выпадения осадка не менее 2-х часов.
Для определения содержания гиппуровой кислоты титрованием осадок, промытый на фильтре до нейтральной реакции промывных вод, слегка подсушивают, чтобы его удобнее было снять с фильтра. Можно и сразу смыть из промывалки осадок с фильтра в химический стакан, на котором нанесена метка 100 мл. До этой метки наливают воду и доводят почти до кипения. Гиппуровая кислота при этом растворяется. Для титрования берут точно 10 мл и титруют 0,5 н. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до розовой окраски.
При определении количества гиппуровой кислоты методом титрования расчет количества выделившейся гиппуровой кислоты производят следующим образом. Например: объем мочи составляет 10 мл. На титрование 5 мл пошло 1,16 мл раствора NaOH: 1 мл 0,5 н раствора NaOH соответствует 0,0895 г гиппуровой кислоты, отсюда 1,16 мл х 0,0895= 0,104 г гиппуровой кислоты.
В норме у человека выделяется за сутки 2,8-3,0 г гиппуровой кислоты.
Эталоны ответов к тестовым заданиям.
Эталоны ответов на ситуационные задачи
В печени происходит обезвреживание токсического индола, поступающего из кишечника . В реакции с ФАФС (фосфоаденозин фосфосульфат) образуется менее токсичный индикан, который выводится из организма с мочой. Увеличение содержания индола свидетельствует о нарушении обезвреживающей функции.
Бензол является летучей, бесцветной жидкостью,хорошо растворимой в маслах. При попадании в организм человека бензол окисляется ферментами микросомального окисления, образуется фенол, который подвергается конъюгации с ФАФС или УДФ-глюкуронатом. Выводится с мочой 30% поступившего бензола в виде фенолсульфата или фенолглюкуроната.
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; Нарушение авторского права страницы
источник
Препараты ГИНК применяют с 1952 г., хотя изониазид был синтезирован в Праге на 40 лет раньше. Главным из них считают изониазид (Isoniazidum), эмпирическая формула которого C6H7N3O. Применяют также метазид (С13Н10N6O2), фтивазид (C14H13N3O3), ларусан (С14H13N3O2), салюзид (C16H15N3O5) и некоторые другие.
Микробиология. Препарат активен в отношении М. tuberculosis (МИК=0,015 мкг/мл). В диких штаммах микобактерий устойчивые формы встречают с частотой 1:100 000.
Фармакодинамика. Изониазид бактерициден, действует на быстро и медленно размножающиеся микобактерии, расположенные вне- и внутриклеточно. В микобактерии его концентрация в 50 раз выше, чем в окружающей среде. Абсолютно необходимое условие для поглощения изониазида микобактерией — аэробиоз. Оптимум действия изониазида соответствует рН=5,0-8,0 при температуре 37 °С. Вероятные механизмы действия — замена никотиновой кислоты на изоникотиновую в реакциях синтеза никотинамид-аденин-динуклеотида (изо-НАД вместо НАД), повышение активности системы флавиновых ферментов с образованием перекиси водорода вместо воды; либо нарушение синтеза воска, входящего в состав клеточной стенки и определяющего кислотоус-тойчивость микобактерии туберкулёза. Существуют и другие гипотезы. Возможно формирование устойчивости М. tuberculosis к препаратам ГИНК.
Фармакокинетика. Изониазид хорошо всасывается из ЖКТ, максимальной концентрации в крови достигает через 1-2 ч после приёма. При использовании терапевтических доз изониазида в крови создаётся концентрация 0,3-3,0 мкг/мл (а МИК=0,015!). Связывание ГИНК с белками составляет менее 10%. Бактериостатический индекс препарата от 10 до 100, а бактериостатическая активность составляет 0,03мкг/мл. Период полувыведения препарата — порядка 6 ч.
Изониазид проникает во все физиологические жидкости — СМЖ, плевральную, асцитическую. Концентрация изониазида в СМЖ составляет 1/3 содержания в плазме крови, однако при менингите проникновение препарата увеличивается в 2 раза.
Судить о концентрации ГИНК в крови можно при помощи оценки бактериостатической активности крови. Для этого кровь больного, получающего препарат, в различных разведениях смешивают со средой, используемой для посева М. tuberculosis.
Препараты группы ГИНК выводятся в виде метаболитов преимущественно почками (50-75% принятой дозы) в течение 24 ч.
Изониазид дезактивируется в организме путём ацетилирования ферментом N-ацетилтрансферазой и гидролиза. Ацетилирование — важный путь метаболизма многих веществ, содержащих группу NH2. По скорости инактивации ГИНК (определяется конкретным генным фенотипом) людей можно разделить на быстрых инактиваторов (ацетиляторов), имеющих период полураспада препарата менее 1 ч, и медленных инактиваторов, имеющих период полураспада ГИНК более 3 ч.
В США среди афроамериканцев быстрое ацетилирование отмечено в 52% случаев, среди представителей европеоидной расы — в 48%, но особенно часто у эскимосов — в 95% случаев. Среди японцев эта величина составляет 88%, у таитян — 72%, тогда как среди британцев — 38%, шведов — 32%, египтян — 18%. Большинство европейцев — медленные ацетиляторы.
Внутривенное введение изониазида обеспечивает проникновение препарата в очаги раньше, чем происходит его ацетилирование в печени, что даёт больший клинический эффект у быстрых инактиваторов. Современная точка зрения такова, что скорость ацетилирования ГИНК существенно не меняет этиотропного эффекта препарата при ежедневном приёме изониазида. Во всемирно известных мадрасских исследованиях связь эффективности лечения со скоростью ацетилирования выявили только при применении повышенных доз ГИНК и интермиттирующем лечении (приём не менее 2 раз в неделю).
У лиц с медленными процессами ацетилирования стандартные дозы ГИНК нередко вызывают периферические невропатии, т.к. препарат вмешивается в метаболизм пиридоксина. Практически проще всем больным назначать небольшие дозы пиридоксина, чем определять тип ацетилирования.
Профилактическое назначение. Изониазид — единственный препарат, используемый при проведении первичной и вторичной химиопро-филактики инфицированных и контактных по туберкулёзу лиц без сочетания с другими туберкулостатиками в суточной дозе 5-10 мг/кг.
В США взрослым рекомендуют ежедневную дозу 0,3 г (5 мг/кг), детям — 10 мг/кг, но не более 0,5 г. В европейских странах химиопро-филактику чаще проводят комбинацией изониазида с рифампицином или препаратами, к которым сохранена чувствительность М. tuberculosis у потенциального источника инфицирования.
Побочные эффекты изониазида изучены хорошо. Знать их необходимо, поскольку многим детям и молодым людям во всём мире назначают этот препарат в период виража туберкулиновых проб.
• Токсическое поражение центральной и периферической нервной системы (периферическая невропатия
• В единичных случаях отмечены тяжёлые лихорадочные реакции при химиопрофилактике изониазидом.
Передозировка и отравления ГИНК сопровождаются тошнотой, рвотой, нарушением зрения и невнятной речью, позднее возможны угнетение дыхания, ступор, кома, трудно купируемые судороги. Если помощь не оказана или оказана в недостаточном объёме, возможен смертельный исход.
Прежде всего обеспечивают контроль за дыханием, при необходимости пациента переводят на искусственную вентиляцию лёгких (ИВЛ). Судороги могут быть купированы внутривенным введением барбитуратов короткого действия или пиридоксина из расчёта 1 мг витамина на 1 мг изониазида. Необходимы срочное исследование крови на содержание сахара и электролитов, а также контроль за кислотно-щелочным состоянием и клубочковой фильтрацией для решения вопроса о необходимости проведения гемодиализа. При отравлении таблетками показано промывание желудка (эффективно в течение нескольких часов после отравления).
Выявление метаболического ацидоза — показание к немедленному введению бикарбоната натрия однократно или повторно (ориентируются по рН, концентрации натрия и т.д.). Изначально показаны осмотические диуретики; их введение продолжают ещё несколько часов после выраженного улучшения состояния. Контролируют объём принимаемой и выделяемой жидкости.
Рассмотрим реальные случаи отравления изониазидом.
• И.К. Казанбиев и соавторы в 1989 г. описали случай приёма с суицидальной целью 5 г (50 таблеток) изониазида. Клиника отравления развилась через 40 мин. Симптомы включали головную боль, судороги, цианоз, ретроградную амнезию, снижение АД, тахикардию, остановку сердца. Своевременные реанимационные мероприятия спасли жизнь больному.
• В другом случае (описали Б.Г. Животовскийн В.Э. Вальтер ъ 1996 г.) пациент 40 лет принял 60 г изониазида (200 таблеток). Через 1,5 ч он потерял сознание, развились рвота, судороги, расстройство дыхания. Бригадой скорой помощи был промыт желудок, в/в введено 5 мл 5% р-ра пиридоксина. Реанимационные мероприятия в палате интенсивной терапии были начаты через 5 ч после приёма ГИНК. Было проведено повторное промывание желудка, поставлен мочевыделительный катетер, имплантирован артериовенозный шунт, подключён аппарат ИВЛ. В течение 3-х суток проводили инфузионную терапию, включавшую 4 мл 0,5% р-ра реланиума, 10 мл 5% р-ра витамина В6, 10 мл ноотропила, 10 мл 5% р-ра витамина С, 5 мл эссенциале, 800 мл 4% р-ра бикарбоната натрия, 1000 мл 10% р-ра глюкозы с 20 ЕД инсулина.
Проводили последовательно вливание 1000 млр-ра Рингера, 400 мл реополиглюкина, 400 мл гемодеза, 1000 мл физиологического раствора, 300 мл нативной плазмы, 80 мг лазикса. Вводили в/м 6 мл 6% р-ра витамина В1, 1 мл 1% р-ра никотиновой кислоты; пенициллин по 6 млн ЕД/сут. Через 6 ч после поступления больного в отделение был проведён 6-часовой гемодиализ (всего 3 раза). На третьи сутки было назначено 5 сеансов лазерного облучения крови. Через 20 дней больной был выписан из токсикологического отделения в удовлетворительном состоянии.
Противопоказания включают индивидуальную непереносимость изониазида (лекарственную лихорадку или артриты), эпилепсию, склонность к судорожным припадкам, полиомиелит в анамнезе, ранее возникавшие токсические гепатиты во время приёма изониазида, острую печёночную недостаточность любой этиологии, выраженный атеросклероз.
ГИНК в дозах, превышающих 10 мг/кг, противопоказан при беременности, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни 2-3 стадии, ЛСН III степени, бронхиальной астме, псориазе и экземе в стадии обострения, хронической почечной недостаточности, остром гепатите и циррозе печени.
Формы выпуска. Таблетки по 0,1, 0,2 и 0,3 г, 10% р-р для внутривенного и внутримышечного введений (25 мг/мл) в ампулах по 2 мл. Нидразид выпускают в растворе (100 мг/мл). Отпуск препаратов ГИНК без рецепта запрещён.
Дозы. Препараты ГИНК чаще принимают ежедневно, а также в интермиттирующем режиме — через день или 2 раза в неделю.
• Изониазид назначают обычно внутрь после еды в дозе 10 мг/кг (до 15 мг/кг), но ВОЗ допускает 5 мг/кг (взрослым 300 мг/сут) при ежедневном и 15 мг/кг при приёме 2-3 раза в неделю (не более 750 мг/сут). Длительность курса не ограничена. Внутримышечное введение 10% р-ра изониазида показано во всех случаях лечения туберкулёза, но особенно — при сопутствующих заболеваниях ЖКТ, уклонении больных от приёма внутрь и контролируемой специфической терапии на амбулаторном этапе.
При экспресс-внутривенном введении применяют дозу 15 мг/кг и через 30 мин в/м вводят 4 мл пиридоксина (частота побочных реакций при экспресс-внутривенном введении достигает 29%, а при внутривенном капельном введении — 35%). Растворяют ГИНК только в воде для инъекций. Обычно в/в капельно вводят 0,2% р-р изониазида из расчёта 10-15 мг/кг.
Изониазид назначают также в виде ингаляций, эндолюмбально (до 2,5 мг/кг), внутриплеврально, внутрикавернозно, внутрибрюшинно. При внутрикавернозном введении преимущество отдают инсуффляции сухого вещества, поскольку минимальное время экспозиции препарата должно быть не менее 1,5 ч.
• Метазид, фтивазид, салюзид. К препаратам группы ГИНК отно сят метазид (Methazidum, доза 20 мг/кг/сут) и фтивазид (Phthivazidurn с характерным запахом ванили, доза 30-40 мг/кг/сут) в таблетках по 0,5 г. Максимальная суточная доза для фтивазида и метазида — 2 г. Существует также салюзид растворимый (Saluzidum solubile) в виде 5% р-ра для введения п/к, в/м, в/в, эндолюмбально, в аэрозоле и эндобронхиально.
Дети. Детям назначают 5-10 мг/кг/сут. При тяжёлых процессах дозу увеличивают до 10-15 мг/кг, но не более 0,5г/сут. Руководства США рекомендуют 10-20 мг/кг, но также не более 0,5 г/сут.
Беременность. По мнению экспертов ВОЗ, при беременности изониазид можно применять при 6-месячном курсе комплексного лечения. В то же время из литературы известно, что при использовании ГИНК в I триместре беременности происходит учащение случаев грубых аномалий развития плода (анэнцефалия, пороки сердца, гидроцефалия, эктопия мочевого пузыря, заращение анального отверстия, гипоспадия, спинномозговые грыжи, расщепление позвонков, косолапость), гемиплегии, замедления психомоторного развития, судорожного синдрома. Известно, что препарат проникает через плацентарный барьер, попадает в материнское молоко, где его концентрация сопоставима с таковой в плазме крови.
Взаимодействие с другими препаратами
- 1. Пиридоксин. Стандарты Минздрава РФ (1998 г.) по лечению больных туберкулёзом органов дыхания предусматривают обязательное назначение пиридоксина 60-100 мг/сут всем больным, получающим изониазид (независимо от пути введения ГИНК). Международные рекомендации при применении 0,3 г/сут не требуют назначения этого витамина лицам без гиповитаминоза, диспротеинемии и алкоголизма, но при прерывистой терапии назначают 15 мг/кг ГИНК в сочетании с 10 мг пиридоксина.
- 2. ПАСК тормозит развитие резистентности к изониазиду, замедляет скорость ацетилирования, конкурирует с изониазидом за N-ацетилтрансферазу печени, метаболизирующую эти препараты, что приводит к увеличению концентрации ГИНК в крови.
- 3. Стрептомицин. При совместном приёме изониазида и стрептомицина их выделение с мочой замедляется. В результате концентрация препаратов в крови повышается, что способствует возникновению нейротоксических побочных эффектов.
- 4. Глюкокортикоиды. Известно, что изониазид снижает эффективность экзогенных кортикостероидов, уменьшая их содержание в крови. Глюкокортикоиды, особенно преднизолон, могут ускорять печёночный метаболизм и/или экскрецию изониазида, приводя к уменьшению концентрации в плазме и снижению терапевтической эффективности этого препарата ГИНК, особенно у пациентов с быстрым типом ацетилирования. При одновременном назначении с кортикос-тероидами дозу изониазида необходимо увеличить. В то же время сочетание дексаметазона с изониазидом повышает вероятность нарушений психики.
- 5. Антациды существенно ухудшают всасывание ГИНК, снижают эффект.
- 6. Сульфаниламиды усиливают побочные эффекты ГИНК (при крайней необходимости назначения сульфаниламидов снижают дозу изониазида).
- 7. Препараты, влияющие на ЦНС. Изониазид усиливает действие трициклических антидепрессантов. Он повышает концентрацию фенитоина и карбамазепина в плазме крови вследствие угнетения их метаболизма в печени. Усиливается также угнетающее действие барбитуратов на ЦНС.
- 8. Противоэпилептические средства в сочетании с изониазидом чаще приводят к интоксикации, особенно у медленных инактивато-ров ГИНК.
- 9. Препараты, понижающие содержание сахара в крови, менее эффективны при одновременном приёме изониазида.
- 10. Сочетание с адреномиметиками приводит к потенцированию эффекта последних. Препараты раувольфии также усиливают эффект ГИНК за счёт снижения скорости его инактивации. ГИНК усиливает антихолинергическое действие М-холиноблокаторов (вероятно потенцирование эффектов атропина, атровента, препаратов красавки).
- 11. Употребление алкоголя во время лечения изониазидом увеличивает риск возникновения гепатита. Нельзя назначать препараты ГИНК одновременно с тетурамом, поскольку могут развиться нарушения движений и поведения.
Коммерческие синонимы. Андразид, динакрин, изониазид («Акрихин», «Дарница», «Медтех», «Мосхимфармпрепараты», Тюменский ХФЗ, Sanavita, Wave International), изоницид, никазид, пелазид, римицид, рип-3 тибизид, тубазид, тибинекс (Themis Chemicals), зоназид, INH США, ИНХ (Sanavita), Nidrazid injection (Apothecon), Rifater (Marion Merrel Dow), Isoniazid (Duramed), а также Metaniazid, Mynex, Niazid, Stanozide, Pelazid, Rimicid, Rimifon, Tebos, Uniad, Zindon и еще несколько сотен синонимов.
Другие препараты группы ГИНК; метазид («Акрихин»; синонимы Methilen-bisTNH, Ro 2-4969), опиназид (салюзид в виде 5% раствора, «Мосхимфармпрепараты»; синонимы Carboxyverazid, Opinazid), фгивазид («Акрихин», Тюменский ХФЗ; синонимы Isovin, Vanizid, Vanillaberon).
источник
А. Г. Хоменко
Биохимические методы позволяют оценить состояние систем гуморальной регуляции и отдельных звеньев обменных процессов, функциональное состояние эндокринных и паренхиматозных органов.
Из сочетания этих компонентов складывается индивидуальное состояние неспецифической реактивности организма больного, которое определяется генетическими факторами, возрастом, наличием сопутствующих заболеваний, аллергией, а также фазой, длительностью и распространенностью туберкулезного процесса в легких.
Биохимические исследования, проводимые в разные периоды наблюдения за больными, имеют различные задачи. При первом контакте больного с врачом решаются вопросы установления диагноза, определения активности и остроты туберкулезных изменений в легких, выбора оптимальных методов специфической и патогенетической терапии. Биохимические сдвиги при развитии любого воспалительного процесса по своей природе неспецифичны, ни один из биохимических тестов не может служить абсолютным диагностическим критерием.
Для оценки наличия и остроты воспалительного процесса в минимальный комплекс исследований целесообразно включить определение количества гаптоглобина, церулоплазмина, С-реактивного белка (СРБ). С целью выявления скрытой реактивности туберкулезного процесса А. Е. Рабухин и Р. А. Иоффе предложили белковотуберкулиновую пробу. Белковые фракции сыворотки крови определяют до подкожного введения 20 ТЕ ППД-Л и через 48 ч после введения.
При наличии скрытой активности под влиянием туберкулина воспаление в очагах «оживляется», что отражается в увеличении количества α2-глобулиновой фракции; проба считается положительной при увеличении а2-глобулинов более чем на 10% от исходного уровня. Чувствительность пробы умеренная, особенно у взрослых больных. Более чувствительным туберкулино-провокационный тест оказывается при использовании в качестве контрольного показателя содержания гаптоглобина. Оценка результатов аналогична приведенной выше. При увеличении содержания гаптоглобина не менее чем на 10% проба считается положительной.
Поскольку в последние годы наблюдается тенденция к нарастанию частоты сочетания туберкулеза с сахарным диабетом, у всех больных при поступлении в стационар необходимо определять содержание глюкозы в крови. При пограничных значениях, превышающих 5,55 ммоль/л (верхняя граница нормы), необходимо проводить пробу на толерантность к глюкозе (нагрузка 50 г. глюкозы с последующим определением уровня ее в крови через 1 и 2 ч). Для оценки состояния печени необходимо иметь представление о целостности ее паренхимы, а также о состоянии желчевыделительной, антитоксической и синтетической функций.
Наиболее широкое распространение для диагностики паренхиматозных повреждений печени получило определение активности аланин- и аспартатаминотрансфераз (АЛаТ и АСаТ). АСаТ содержится не только в гепатоцитах, но и в клетках миокарда и поперечнополосатых мышц. Поэтому при инфаркте миокарда и массивной травме мышечной ткани (например, при операции) активность этого фермента в крови может кратковременно нарастать у больных с неповрежденной печенью.
Значительно более специфичным для паренхиматозных повреждений печени является повышение активности AЛaT и отношения АСаТ/АЛаТ, которое в норме колеблется в пределах 1. Возрастание активности аминотрансфераз в пределах удвоенной нормы обычно свидетельствует об умеренно выраженных повреждениях, а выше удвоенной и тем более утроенной нормы — о развернутой картине паренхиматозного гепатита.
Увеличение активности лактатдегидрогеназы-5 (ЛДГ5) на фоне положительной динамики легочного процесса и субъективно хорошей переносимости лечения служит ранним признаком начальных лекарственных повреждений гепатоцитов до их клинического проявления. Определяют активность и других ферментов, органоспецифических исключительно для печени (фруктозо-1-монофосфатальдолаза, урокининаза).
Определенное представление об антитоксической функции печени дает фракционное исследование билирубина крови. Если процесс связывания билирубина в печени нарушен, то в крови умеренно повышается содержание непрямого (свободного) билирубина, тогда как прямая реакция остается отрицательной. Аналогичная ситуация может сложиться при значительном гемолизе, когда печень не успевает «справляться» с большим количеством поступающего свободного билирубина (гемолитическая желтуха).
Однако значительный гемолиз обычно имеет и другие проявления (анемия, возникновение молодых форм эритроцитов). Вне гемолиза увеличение уровня непрямого билирубина при отрицательной прямой реакции свидетельствует о нарушении антитоксической функции печени (способность образовывать парные соединения) и часто сопутствует (а иногда и предшествует) развитию побочных реакций на противотуберкулезные препараты.
Вариантом оценки антитоксической функции печени служит изучение ее экскреторной функции, которое проводят при помощи бромсульфалеиновой пробы. Эта проба очень чувствительна, проста в исполнении и позволяет получить достоверные данные для прогноза и раннего выявления побочного действия лекарств.
О нарушении желчевыделительной функции печени (холестаз) свидетельствует повышение в крови содержания тех соединений, которые являются нормальными компонентами желчи (прямой билирубин, щелочная фосфатаза, γ-глутамилтранспептидаза, липопротеиды). Если количество этих соединений возрастает, а активность аминотрансфераз остается в пределах нормы, то следует думать о холестазе, если имеется одновременное повышение обоих показателей — о паренхиматозном гепатите.
Паренхиматозные изменения чаще возникают в результате применения гепатотоксичных лекарств, а явления холестаза — при развитии токсико-аллергических реакций на любые препараты. Пробы на коллоидную устойчивость сывороточных белков помогают выявить как паренхиматозный, так и интерстициальный (параспецифический, токсико-аллергический) гепатит. Вариантами этих проб являются сулемовая, проба Вельтмана, реакция Такала — Ара, тимоловая проба.
При развитии лекарственной аллергии к любым препаратам нередко в процесс вовлекаются почки, развиваются аллергические гломерулиты и васкулиты. Поэтому функциональное исследование почек необходимо не только до начала лечения, но и в процессе его. Показаниями к таким повторным исследованиям служат применение потенциально нефротоксичных антибиотиков (через 2 мес после начала лечения и затем ежемесячно) и развитие выраженных аллергических реакций на любые препараты (в ближайшие 1-2 дня после реакции).
Минимальную и в то же время достаточную для оценки состояния почек информацию дает определение их фильтрационной, концентрационной и азотовыделительной функций. Всем этим требованиям отвечает проба Реберга-Тареева, дополненная определением уровня мочевины или остаточного азота крови.
При первом исследовании умеренное снижение примерно до 60 мл/мин начального процесса мочеобразования — клубочковой фильтрации — может сопутствовать инфильтративной фазе туберкулезного процесса (токсико-инфекционная почка). Такое снижение не является противопоказанием к применению потенциально нефротоксичных антибиотиков, а по мере снятия явлений туберкулезной интоксикации величина клубочковой фильтрации нередко нарастает. Снижение фильтрации в процессе лечения следует рассматривать как проявление побочного действия лекарств. Исходная клубочковая фильтрация ниже 60 мл/мин отражает наличие осложнений туберкулеза (амилоидоз, сердечная недостаточность) или сопутствующих почечных заболеваний.
Во всех этих случаях, кроме сердечной недостаточности, назначение потенциально нефротоксичных антибиотиков нежелательно, так как, во-первых, при исходной почечной патологии чаще выявляется их нефротоксическое действие, а во-вторых, указанные антибиотики выделяются из организма преимущественно по механизму клубочковой фильтрации и при значительном снижении последней возможна кумуляция препаратов в организме с нарастанием их ототоксического эффекта.
При развитии лекарственной аллергии, а также в ранних стадиях амилоидоза (в обоих случаях за счет повышения проницаемости клубочкового фильтра) иногда наблюдается патологическое увеличение клубочковой фильтрации — более 150 мл/мин. Снижение концентрационной способности почек, о чем свидетельствует уменьшение реабсорбции воды в канальцах ниже 97% и концентрационного индекса эндогенного креатинина ниже 40, всегда говорит о значительной давности и распространенности патологического процесса в почках и функциональной неполноценности почек.
Азотовыделительная функция почек не нарушается длительно, пока сохраняется не менее 30% почечной паренхимы. Поэтому увеличение количества азотистых шлаков крови в процессе лечения (и даже в пределах нормы) должно привлекать внимание, а превышение верхней границы нормы всегда свидетельствует о почечной недостаточности.
Следующим аспектом исходного биохимического исследования является оценка способности организма больного метаболизировать лекарства. Как эффект лечения, так и частота и выраженность побочных реакций токсического характера в значительной степени определяются «высотой» максимальных концентраций и длительностью циркуляции лекарственных препаратов в крови, а также путями их обезвреживания (инактивации).
Так, темп ацетилирования ГИНК в организме при полноценном функционировании печени генетически детерминирован, не изменяется с возрастом и в процессе лечения. Все люди по скорости, с которой у них происходит ацетилирование ГИНК, делятся на быстрых и медленных инактиваторов (ацетиляторов). У медленных инактиваторов в метаболизм ГИНК включаются процессы микросомного окисления в печени, при этом образуются продукты, более токсичные, чем ацетилизониазид.
Свободный ГИНК и продукты его метаболизма выводятся почками, поэтому по содержанию этих соединений в моче (суточной или порционной) можно судить о характере инактивации препарата в организме. Установление типа инактивации целесообразно проводить в самом начале для определения режима лечения (дозы, ритм).
Среди систем гуморальной регуляции большое внимание на формирование неспецифической реактивности оказывает состояние калликреин-кининовой системы крови (КС). КС в организме выполняет функцию физиологической адаптации кровообращения к изменяющимся условиям внешней и внутренней среды. Локальная активация КС обусловливает местную гиперемию, повышение сосудистой проницаемости, хемотаксис нейтрофилов.
По сути это является защитной реакцией при повреждении тканей, но при нарушении физиологического контроля внутри системы может выступить в качестве неуправляемого фактора воспаления. При аллергических реакциях образование комплексов антиген-антитело приводит к генерализованной активации КС с тотальным повышением сосудистой проницаемости и снижением артериального давления.
Ранним фазам активного туберкулезного процесса в легких сопутствует адаптивная компенсированная активация КС, что проявляется в равномерном сбалансированном увеличении содержания всех ее компонентов (предшественников, кининообразующего фермента калликреина, кининразрушающих ферментов).
У лиц с сомнительной активностью патологического процесса при подкожном введении 20 ТЕ ППД-Л через 24 ч наблюдается отчетливое повышение уровня калликреина, а через 48 ч увеличивается активность кининразрушающей кининазы I, что позволяет использовать этот тест как один из вариантов туберкулинпровокационных проб.
При развитии деструкции, выраженной интоксикации, генерализации процесса, на высоте аллергических и токсико-аллергических лекарственных реакций КС активируется из-за высокого уровня калликреина при подавлении активности кининразрушающих ферментов (иногда с истощением предшественников). Такое состояние КС служит патогенетическим фактором в развитии указанных состояний и требует лекарственной коррекции антикининовыми препаратами [Каминская Г. О. и др., 1979; Свистунова А. С., 1980; Макинский А. И., 1981; Келеберда К. Я. и др., 1982].
Не меньшее значение в формировании характера ответной реакции организма на внедрение возбудителя туберкулеза имеет ситема универсальных биорегуляторов простагландинов (ПГ) и «сопряженных» с ними внутриклеточных посредников в действии на клетки гормонов и биологически активных веществ — циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ). ПГ различных классов (Е и F2a
оказывают сильное и разнонаправленное действие как на состояние сосудистой проницаемости и хемотаксис фагоцитирующих клеток, так и на реакции клеточного иммунитета. Благоприятному течению туберкулезного процесса сопутствует сбалансированный рост уровня ПГ Е и при прогрессировании процесса физиологические сотношения между обоими классами ПГ нарушаются [Сокол Т. В., 1984].
Существенное влияние на состояние неспефической реактивности оказывает усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). При туберкулезной интоксикации такое усиление приобретает универсальный характер, отрицательно влияя на течение локального процесса, толерантность к туберкулостатикам и выраженность остаточных фиброзных изменений.
Биохимические методы позволяют оценить интенсивность ПОЛ по количеству начальных и конечных продуктов этого процесса (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) и степень эндогенной антиоксидантной защиты (антиокислительная активность, содержание в крови естественного антиоксиданта α-токоферола). Выраженность и сбалансированность процессов ПОЛ четко коррелируют с фазой туберкулезного процесса и степенью интоксикации и вместе с тем служат обоснованием и критерием для применения антиоксидантной терапии.
Деятельность систем гуморальной регуляции в значительной степени детерминирована функциональным состоянием коры надпочечников. Вследствие адаптивной природы деятельности данного органа при свежих формах туберкулеза легких функция коры надпочечников «возбуждается», что увеличивает продукцию как противовоспалительных глюкокортикоидов, так и провоспалительных минералокортикоидов.
Соотношение между выделением этих двух классов гормонов у различных больных может сильно варьировать. При относительном преобладании противовоспалительных глюкокортикоидов создаются предпосылки для ограничения процесса и торпедного его течения, а избыток минералокортикоидов (дискортицизм), напротив, обусловливает экссудативный характер процесса, склонного к прогрессированию. Кроме того, при последнем варианте соотношений кортикостероидов значительно выше возможность развития побочных реакций на противотуберкулезные препараты [Гурьева И. Г., 1974].
При известной продолжительности процесса и выраженности интоксикации функциональные резервы коры надпочечников постепенно истощаются. Вначале это истощение носит латентный характер: содержание гормонов в крови и экскреция их с мочой повышены. Однако такой уровень предельный, и при нагрузке АКТГ функция коры надпочечников не усиливается, иногда наблюдается парадоксальный эффект. При стрессе (операция) может развиться острая сердечно-сосудистая недостаточность вплоть до коллапса и шока.
У больных с хроническими формами туберкулеза легких при большой продолжительности заболевания полностью истощаются функциональные резервы коры надпочечников, и орган уже не может не только адекватно ответить на дополнительную нагрузку, но и обеспечить стабильный физиологический уровень гормонов в крови.
В таких условиях возникает состояние гипофункции коры надпочечников (гипокортицизм, «малый аддисонизм»), выявляемое клинически и создающее предпосылки к острому прогрессирующему течению туберкулезного процесса в легких и низкой толерантности к туберкулостатикам. Если состояние латентной гипофункции надпочечников приобретает большое значение в хирургической практике, то клинически выявляемый гипокортицизм предопределяет необходимость в гормонотерапии у терапевтических больных.
Биологическим материалом для исследования функционального состояния коры надпочечников служат кровь и моча. Поскольку у человека кортикостероидные гормоны и их метаболиты выделяются почками, по их содержанию в суточной моче можно оценить уровень экскреции (и соответственно, секреции). С мочой выделяются как продукты полного метаболизма гормонов 17-кетостероиды (17-КС), так и неизмененные гормоны или метаболизированные частично с сохранением их биологических свойств — 17-оксикортикостероиды (17-ОКС).
Определение только суточной экскреции 17-КС, нередко рекомендуемое для оценки функционального состояния коры надпочечников у больных туберкулезом, недостаточно информативно, поскольку 17-КС образуются в печени, а при ее недостаточности синтез и выделение гормонов могут падать, количество же неметаболизированных активных гормонов, циркулирующих в крови, напротив, увеличивается.
Кроме того, 17-КС являются продуктами метаболизма не только кортикостероидов, но и мужских половых гормонов. Поэтому полное представление о «размерах» секреции гормонов корой надпочечников дает лишь определение суточной экскреции одновременно 17-КС и 17-ОКС. При этом высокий уровень экскреции данных соединений может маскировать состояние латентной недостаточности, которое выявляется только путем двукратных исследований до и после 3-дневной нагрузки АКТГ.
Определение в крови суммарного содержания 17-ОКС, их свободных и белковосвязанных форм, а также концентраций гидрокортизона и кортикостерона (или альдостерона) позволяет определять биологическую активность циркулирующих гормонов и взаимоотношение между их глюкокортикоидным и минералокортикоидным компонентами.
источник
Основные методы разделения и выделения веществ при биохимических исследованиях. Количественное определение белка в сыворотке крови. Химическая природа нуклеопротеидов. Применение единиц СИ для выражения результатов клинико-биохимических исследований.
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
2. Биохимическое исследование мочи
Моча образуется и выделяется почками. Первичная моча представляет собой ультрафильтрат крови. Она содержит все компоненты крови, кроме форменных элементов и белков, масса которых превышает 50000. В результате реабсорбционных и секреторных процессов в канальцах и собирательных трубках почек формируется окончательная моча. Изменения функции и повреждения различных органов отражаются на химическом составе крови, а следовательно, на компонентах ее ультрафильтрата (первичная моча) и затем на составе окончательной мочи. Нарушения деятельности почек непосредственно сказываются на физико-химических свойствах выделяемой мочи и содержании в ней различных веществ. Поэтому биохимические исследования мочи играют важную роль в клинике для диагностики и определения прогноза заболевания, а также для контроля за эффективностью проводимого лечения.
В состав мочи входят вода, органические и минеральные соли, всего около 150 веществ. В клинико-биохимических лабораториях проводят общий и специальный анализ мочи. Общий анализ включает исследование физико-химических свойств мочи и определение в ней ряда патологических компонентов: белок, сахар, кетоновые (ацетоновые) тела, гемоглобин, пигменты и индикан. При необходимости подсчитывают также количество эритроцитов и лейкоцитов в моче. Общий анализ обязателен при первичном обследовании пациента и диспансерном наблюдении. Специальный анализ, т.е. определение прочих компонентов мочи (метаболиты, ферменты, отдельные минеральные вещества и т.д.) проводится при подозрении на поражение конкретного звена обмена или определенного органа.
Оборудование. Мерный цилиндр вместимостью 1 или 2 л; урометры с делениями от 1,000 до 1,030 кг/л и от 1,030 до 1,060 кг/л; термометр; фильтровальная бумага; стеклянные цилиндры вместимостью 50 или 100 мл; универсальная индикаторная бумага; стаканчик.
а. Характеристика суточного объема мочи (диурез). Суточный объем мочи замеряют с помощью мерного цилиндра на 1 или 2 л. В норме он составляет в среднем 1500 мл у мужчин и 1200 мл у женщин. Объем мочи выше 2200 мл и ниже 500 мл в сутки указывают на патологию.
б. Характеристика цвета мочи. Цвет мочи оценивают визуально. В норме он соломенно-желтый и обусловлен присутствием пигментов: урохрома (темно-желтый), уробилина (бледно-розовый), уроэритрина (бледно-красный).
При патологии или приеме с пищей красящих веществ цвет мочи меняется. Бледно-желтая или почти бесцветная моча характерна для полиурии (сахарный и несахарный диабет), почечные заболевания.
Красная окраска бывает при гемоглобин- и миоглобинурии или от пищевых красителей, содержащихся в конфетах, чернике, смородине, свекле и т.д. Коричнево-темный цвет наблюдается при алкаптонурии или меланинурии.
Зелено-синяя окраска отмечается при бактериальном загрязнении мочи или избытке в ней индикана, который превращается в синее индиго.
в. Оценка прозрачности мочи. Прозрачность мочи оценивается визуально. В норме моча прозрачна; при стоянии из нее осаждается рыхлая слизистая масса, состоящая из слущенного эпителия мочевых путей и слизистых телец.
Помутнение мочи может быть вызвано присутствием в ней избытка солей (ураты, фосфаты, оксалаты, карбонаты) или слизи, гноя, микробов и слущенных клеток.
г. Определение запаха мочи. В норме запах мочи ароматический, напоминающий запах мясного бульона или миндаля. Пахучие пищевые вещества или лекарства могут придавать моче свойственный им запах. Загнившая моча имеет запах аммиака, при разложении клеток в мочевых путях моча приобретает гнилостный запах, а присутствие большого количества кетоновых тел (сахарный диабет) придает ей плодовый запах.
д. Исследование плотности мочи. Стеклянный цилиндр ставят строго вертикально и наливают в него мочу. Если образуется пена, ее снимают фильтровальной бумагой. Осторожно погружают в мочу сухой урометр так, чтобы он свободно плавал, не касаясь стенок цилиндра, и производят отсчет по отметке шкалы урометра, совпадающей с нижним мениском жидкости.
По шкале урометра сразу находят плотность мочи (в кг/л), но так как он откалиброван при определенной температуре (чаще всего при 15?С), необходимо внести поправку на температуру мочи. Для этого на каждые 3?С выше 15?С прибавляют по 0,001 кг/л к измеренной плотности и, наоборот, если температура ниже 15?С,на каждые 3?С вычитают по 0,001 кг/л.
е. Определение рН мочи. Полоску универсальной индикаторной бумаги погружают в исследуемую мочу, вынимают ее и определяют по цветной шкале рН.
В норме рН мочи колеблется от 5,0 до 7,0. Сдвиг рН в кислую сторону отмечается при выделении ацетоновых тел (сахарный диабет, голодание) или при тяжелой недостаточности почек. Смещение рН в щелочную сторону наблюдается при употреблении с пищей гидрокарбонатов, щелочных минеральных вод, молочно-растительных продуктов, воспалении слизистой мочевого пузыря и после длительной рвоты.
Оформление работы. Занести полученные данные анализа в тетрадь, сделать вывод о характерных изменениях и указать причины.
Реактивы. Нитропруссид натрия, 10%-ный раствор свежеприготовленный; уксусная кислота, конц.; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; хлорид железа (III), 10%-ный раствор.
а. Проба Легаля на ацетон и ацетоуксусную кислоту мочи. Метод основан на способности ацетона и ацетоуксусной кислоты в щелочной среде образовывать с нитропруссидом натрия комплексы оранжево-красного цвета, а при подкислении раствора — соединений вишнево-красного цвета.
Ход определения. В одну пробирку вносят 10 капель нормальной, в другую — 10 капель патологической мочи и добавляют в обе пробы по 2 капли раствора нитропруссида натрия и по 4 капли раствора гидроксида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание.
Вносят в обе пробирки по 10 капель концентрированной уксусной кислоты, при этом возникает вишнево-красное окрашивание.
Примечание. Креатинин мочи с нитропруссидом натрия также дает оранжево-красное окрашивание, но при добавлении концентрированной уксусной кислоты жидкость окрашивается в желтый цвет.
б. Проба Герхарда на ацетоуксусную кислоту мочи. Метод основан на взаимодействии железа с енольной формой ацетоуксусной кислоты с образованием комплекса красно-фиолетового цвета.
Ход определения. В одну пробирку вносят 20 капель нормальной, а в другую — 20 капель патологической мочи и прибавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) в обе пробы. Развивается красно-фиолетовое окрашивание.
в. Экспресс-тест на ацетон мочи.
Ход определения. На каждую из таблеток наносят по 2 капли нормальной и патологической мочи. Через 2 мин сравнивают окраску таблеток с цветной шкалой, приложенной к набору. При отсутствии ацетона окраска не развивается.
г. Определение глюкозы в моче с помощью набора «Глюкотест». Метод основан на визуальной оценке изменения цвета красителя (о-толидин), которым пропитана полоска бумаги «Глюкотест»; по цветной шкале устанавливают примерное содержание глюкозы в моче.
Ход определения. Одну полоску бумаги «Глюкотест» смачивают нормальной, а другую — патологической мочой. Сравнивают через несколько минут окраску полосок с цветной шкалой, имеющейся в комплекте. Содержание глюкозы в моче определяют по наиболее совпадающему со шкалой цвету полоски.
Оформление работы. Результаты занести в таблицу.
Сделать вывод о присутствии ацетоновых тел и глюкозы в образцах нормальной и патологической мочи и указать на вероятные их причины.
Практическое значение работы. В норме пробы на ацетоновые тела и глюкозу в моче отрицательны.
Одновременное выделение ацетоновых тел и глюкозы с мочой наблюдается наиболее часто при сахарном диабете, реже при действии глюкокортикоидов (стероидный диабет), соматотропина и кортикотропина. Глюкозурия без ацетонурии имеет место при употреблении большого количества углеводов с пищей, а ацетонурия без глюкозурии — при голодании.
Метод основан на пробе Геллера, состоящей в том, что при наслаивании мочи, содержащей белок, на концентрированную азотную кислоту образуется мутное белое кольцо денатурированного белка. Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,033 г/л белка, дают это кольцо между 2-й и 3-й минутами после наслаивания.
Ход определения. Проводят пробу Геллера с нормальной и патологической мочой, для чего вносят в пробирку 20 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно из пипетки наслаивают мочу. Если в моче содержится белок, то через 2-4 мин образуется белая муть в виде кольца.
Мочу с положительной пробой Геллера используют для количественного определения белка, для чего готовят разведение мочи. В пять пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды. В первую вносят 2 мл мочи, перемешивают и отбирают 2 мл смеси и переносят во вторую и т.д. Из последней пробирки 2 мл набранной жидкости отбрасывают. Получается моча, разведенная в 2, 4, 8, 16 и 32 раза.
В другие пять пробирок отмеривают по 2 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно с помощью пипетки наслаивают на кислоту соответствующую пробу разведенной мочи.
Отмечают максимальное разведение мочи, при котором появляется мутное колечко между второй и третьей минутами.
Расчет. Найденное разведение мочи умножить на 0,033 г/л. Например, кольцо денатурированного белка образовалось в четвертой пробирке, где разведение равно 16. Следовательно, содержание белка в исследуемой моче 0,033·16 = 0,528 г/л.
Оформление работы. Рассчитать содержание белка в патологической моче и указать на использование метода в практике.
Реактивы. Свинца ацетат (100 г/л); железо хлорное; кислота соляная концентрированная, пл. 1,19; реактив Обермейера; 0,2-0,4 хлорного железа и 100 мл концентрированной соляной кислоты; хлороформ.
Принцип метода основан на способности индикана с реактивом Обермейера в присутствии хлороформа окрашиваться в синий или красный цвет.
Ход определения. 1 мл мочи смешивают с раствором ацетата свинца в отношении 1:10, фильтруют. Смешивают 1-2 мл фильтрата с реактивом Обермейера в соотношении 1:1, прибавляют 0,5-1,0 мл хлороформа и опрокидывают пробирку несколько раз. Если слой хлороформа окрашивается в синий или красный цвет, то проба положительная.
Оформление работы. По полученному окрашиванию сделать вывод о возможности использования данной реакции в диагностике патологических процессов.
Практическое значение работы. В норме индикан содержится в моче в незначительном количестве и не обнаруживается качественными пробами. Индиканурия встречается при интенсивном гниении белковых веществ в кишечнике, а также при усиленном распаде белков в организме.
Реактивы. Бензидин, 1%-ный раствор в 32%-ной уксусной кислоте; пероксид водорода, 3%-ный раствор; иод, 1%-ный спиртовой раствор.
а. Бензидиновая проба на кровяные пигменты в моче. Принцип метода см. работу 9, а.
В одну пробирку вносят 5 капель нормальной, а в другую — патологической мочи и добавляют по 3 капли бензидинового реактива и раствора пероксида водорода. При наличии пигментов появляется сине-зеленая окраска.
б. Проба Розина на желчные пигменты в моче. Метод основан на образовании из билирубина под действием иода биливердина, окрашенного в зеленый цвет.
Ход определения. В одну пробирку вносят 5 мл нормальной, а в другую патологической мочи и осторожно наслаивают раствор иода. Если в моче присутствует билирубин, на границе двух жидкостей появляется зеленое кольцо.
Метаболизм ксенобиотиков осуществляется с участием ферментов, содержащихся в тканях и жидкостях организма. Их состав определяет специфичность превращения любого чужеродного соединения. Метаболизм ксенобиотиков зависит от пути поступления их в организм. В пищеварительном тракте возможен гидролитический распад чужеродных веществ, в биологических жидкостях они подвергаются и некоторым другим превращениям (оксидоредукции, конъюгации), а в клетках происходят самые разнообразные реакции биотрансформации ксенобиотиков (см. учебник, с.444-455).
Наиболее активно ферментативные превращения ксенобиотиков осуществляются в клетках печени. Среди них следует отметить реакции окисления веществ, осуществляемые монооксигеназной ферментативной системой мембран эндоплазматической сети (микросом) печени. В микросомальной цепи протекают окислительные реакции двух типов: реакции гидроксилирования природных (аутобиогенных) и чужеродных соединений и реакции пероксидного окисления ненасыщенных жирных кислот (А.И.Арчаков, 1975).
Для исследования метаболизма ксенобиотиков возможны два подхода:
определение состава и содержания метаболитов введенных ксенобиотиков в биологических жидкостях и экскретах;
определение активности ферментов, участвующих в превращении ксенобиотиков, и изучение кинетики действия данных ферментов на различные соединения.
В экспериментах применяют оба подхода; в клинике метаболизм лекарственного средства оценивают, как правило, по содержанию в биологических жидкостях изучаемого вещества и его продуктов обмена.
1. Исследование процессов окисления и конъюгации ксенобиотиков
Дыхание микросом — процесс окисления веществ кислородом с образованием воды — можно изучать или по скорости потребления кислорода, или по использованию восстановленного НАДФ, или НАД, участвующих в этих реакциях.
Реактивы. Хлорид калия, 1,15%-ный раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4*; хлорид кальция, 0,04 М раствор; НАДФ·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный; НАД·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный.
Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1; 5; 10 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; чашки Петри; мерный цилиндр вместимостью 25 мл; фильтровальная бумага; шприц с иглой; гомогенизатор с пестиком из тефлона; аптечные весы с разновесами; моторчик для гомогенизации; флуороскоп; центрифуга ЦЛР.
Материал. Печень (свежая) забитого животного.
а. Выделение микросомальной фракции из печени крысы. Метод основан на разной скорости осаждения субклеточных частиц печени при центрифугировании в зависимости от их размера и плотности. Для уменьшения фактора осаждения микросом добавляется хлорид кальция, вызывающий их преципитацию.
Ход определения. После забоя животного печень отмывают от крови раствором хлорида калия из шприца, обсушивают ее фильтровальной бумагой и помещают в чашку Петри, стоящую на льду.
3 г ткани печени измельчают ножницами и переносят в стакан гомогенизатора, куда предварительно наливают 9 мл охлажденного раствора хлорида калия. Стакан помещают в лед и размельчают ткань с помощью тефлонового пестика при 1000 об/мин, делая 15-20 движений стаканом вверх-вниз.
Гомогенат разливают в две центрифужные гильзы и центрифугируют на ЦЛР при 10000g в течение 20 мин при 0-4?С. Надосадочную жидкость сливают в другие центрифужные гильзы, прибавляют к ней раствор хлорида кальция в соотношении 1:5 по объему. Перемешивают и вновь центрифугируют при 3000g в течение 15 мин при 0-4?С.
Надосадочную жидкость сливают. К осадку, содержащему обогащенную фракцию микросом, добавляют 3 мл раствора трис-буфера и с помощью пипетки, втягивая и выдувая жидкость, получают взвесь микросом.
б. Обнаружение дыхательной активности микросом печени флуориметрическим методом. Метод основан на наблюдении за скоростью падения флуоресценции НАДФ·Н или НАД·Н в процессе их окисления препаратами микросом.
Ход определения. В две пробирки наливают по 2,8 мл трис-буфера. Затем в одну из них добавляют 0,1 мл полученной взвеси микросом, а в другую — 0,1 мл дистиллированной воды (контрольная проба).
Ставят обе пробирки в штатив предварительно включенного флуороскопа, вносят в них по 0,1 мл раствора НАДФ·Н или НАД·Н и быстро перемешивают стеклянной палочкой.
Наблюдают за изменением флуоресценции в обеих пробах.
Оформление работы. По изменению флуоресценции указать на наличие дыхательной функции микросом.
Практическое значение работы. Выделение микросом используется в научных исследованиях для изучения их функций, в том числе дыхательной, при различных физиологических состояниях и при патологии, а также для исследования действия лекарств и ядов.
Работа 101. Исследование окислительного N-деметилирования в микросомах печени по Нашу
Реактивы. Гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив*; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4*; НАДФ·Н, 1 мМ раствор, свежеприготовленный; хлорид магния, 2,5 мкМ раствор; амидопирин, 80 мМ раствор; сульфат цинка, 25%-ный раствор; гидроксид бария, насыщенный раствор; реактив Наша*.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1; 2 и 5 мл; спектрофотометр.
Материал. Взвесь микросом печени, полученная в работе 85, а.
Метод основан на измерении содержания в среде формальдегида, образующегося при окислительном N-деметилировании амидопирина в микросомах:
Формальдегид дает с реактивом Наша комплекс желтого цвета.
Ход определения. Проверяют содержание белка в микросомальной фракции, для чего помещают в пробирку 0,05 мл взвеси микросом, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива. Смесь перемешивают и через 30 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной (4 мл раствора NaOH и 0,2 мл биуретового реактива) на СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Экстинкции 0,30-0,60 примерно соответствует содержание белка 2-4 мг в 0,1 мл взвеси микросом. Если экстинкция выше, то необходимо взвесь микросом разбавить трис-буфером так, чтобы получилась нужная концентрация белка.
В опытную и контрольную пробирки вносят по 0,4 мл растворов трис-буфера и хлорида магния, по 0,2 мл НАДФ·Н и по 0,1 мл взвеси микросом. Перемешивают содержимое пробирок.
В опытную пробу добавляют 0,11 мл раствора амидопирина, а в контрольную — сначала по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария, а затем 0,11 мл амидопирина. Содержимое перемешивают.
Помещают обе пробирки на 20 мин в водяную баню при 37?С, периодически встряхивая пробы. По окончании инкубации реакцию в опытной пробе останавливают, добавив по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария. Содержимое перемешивают.
Центрифугируют обе пробы при 3000 об/мин в течение 10 мин.
Отбирают по 1 мл надосадочной жидкости в две другие пробирки и приливают в них по 2 мл реактива Наша. Ставят пробы на 45 мин в водяную баню при 37?С.
Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на СФ при 412 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Расчет проводят по формуле:
где х — скорость N-деметилирования амидопирина, мкмоль/(мин·кг печени);
а — количество формальдегида, найденное по калибровочному графику (рис.12), нмоль;
V — объем взвеси микросом в трис-буфере, мл;
1,71 — объем инкубационной смеси, мл;
0,1 — объем взвеси микросом, взятый на исследование, мл;
333 — коэффициент пересчета на 1 кг ткани печени;
1000 — коэффициент пересчета нмоль в мкмоль.
Оформление работы. Рассчитать скорость микросомального окисления амидопирина. В выводе указать на значение этого процесса.
Практическое значение работы. Исследование окисления ксенобиотиков монооксигеназной цепью микросом дает возможность оценить функцию этого процесса в норме и патологии, а также изучить особенности превращения различных соединений, токсичность и действие их продуктов на организм.
Работа 102. Определение гидроксилазной активности микросом печени по Като и Жилете
Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,08 М раствор с рН 7,4*; хлорид магния, 0,16 М раствор; анилин перегнанный, 0,03 М раствор; трихлоруксусная кислота, 15%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; фенол, 2%-ный раствор в 0,2 М растворе гидроксида натрия; НАДФ•Н, 0,03 М раствор; биуретовый реактив*; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; реактивы для выделения микросом, как в работе 86; 4-аминофенол, свежеприготовленный раствор для построения калибровочного графика. (5,45 мг/л).
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторная центрифуга с центрифужными весами; центрифуга рефрижераторная ЦЛР; ФЭК типа КФК-2 или спектрофотометр.
Материал. Печень животного после забоя.
Метод основан на определении содержания 4-аминофенола, образующегося при гидроксилировании анилина в монооксигеназной цепи микросом и с участием цитохрома Р450:
4-аминофенол при взаимодействии с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный индофенольный комплекс синего цвета:
Ход определения. Выделяют фракцию микросом печени, как указано в работе 100, затем определяют содержание белка в полученной микросомальной фракции; для этого отбирают 0,05 мл взвеси микросом в пробирку, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0.2 мл биуретового реактива.
Перемешивают содержимое стеклянной палочкой и через 30 мин измеряют экстинкцию этого раствора против контрольного (4 мл гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива) на ФЭКе и СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Рассчитывают концентрацию белка по калибровочному графику (содержание белка в 0,1 мл взвеси микросом должно составлять примерно 2-4 мг).
Для изучения гидроксилирования анилина берут две чистые пробирки и готовят контрольную и опытную пробы. Последовательность внесения компонентов и их объем приведены в таблице.
Обе пробирки помещают на 20 мин в водяную баню при 37?С, после чего в опытной пробе останавливают реакцию, приливая 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Далее обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.
Отбирают из каждой пробы по 1 мл надосадочной жидкости, переносят их в две другие пробирки. Затем приливают к ним по 0,5 мл карбоната натрия и по 1,5 мл раствора фенола. Перемешивают содержимое встряхиванием.
Для развития окраски пробирки помещают на 30 мин в водяную баню при 37?С. Затем измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе или СФ при 630 нм (светофильтр красный).
Серию растворов для построения калибровочного графика готовят согласно таблице.
Содержание 4-аминофенола в пробе, нмоль
Затем пробирки ставят на 30 мин в водяную баню при 37?С. Измеряют экстинкцию проб против контроля, как описано выше, и строят калибровочный график.
Расчет проводят по формуле
где х — гидроксилазная активность нмоль/(мин•мг белка);
А — содержание 4-аминофенола в пробе, найденное по калибровочному графику, нмоль;
V — объем пробы, равный 1,71 мл;
m — содержание белка в пробе, мг.
Практическое значение работы. Для изучения функции микросомальной цепи окисления печени в норме и особенно при патологических состояниях используют различные методические подходы. В частности, исследования проводят с разными субстратами, превращение которых происходит на цитохроме Р450. При взаимодействии с цитохромом Р450 разные субстраты дают неодинаковые спектры поглощения. По этому признаку их условно делят на субстраты I типа (к ним относятся, например, амидопирин, бензфетамин, этилморфин и др.) и II типа (анилин), что связано, возможно, с некоторыми различиями в механизме гидроксилирования данных соединений.
Скорость реакций гидроксилирования изменяется при действии многих внешних факторов (радиации, гипероксии, гипоксии, интоксикации четыреххлористым углеродом и т.д.), под влиянием ряда регуляторов (витаминов, гормонов). Для получения более полной информации о деятельности гидроксилазной активности микросом печени при действии многих факторов и при патологии используют разные ксенобиотики — субстраты цитохрома Р450.
Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по Т.А. Попову и О.Д. Леоненко
Метаболизм амидопирина осуществляется с помощью ферментативных реакций окисления и конъюгации. Первая из них (N-деметилирование) катализируется монооксигеназной ферментной системой эндоплазматической сети печени по уравнению
Далее 4-аминоантипирин с участием соответствующей N-ацетилтрансферазы и ацетил-КоА подвергается ацетилированию:
Реактивы. Фенол перекристаллизованный, 0,02%-ный раствор; аммиачный буфер с рН 10,5-10,6 (20 г хлорида аммония растворяют в 100 мл 25%-ного раствора аммиака); трихлоруксусная кислота, 12,5%-ный раствор; соляная кислота, 36%-ная; гексацианоферрат (III) калия, 1%-ный раствор; 4-аминоантипирин, свежеприготовленный стандартный раствор 1 мг/мл для построения калибровочного графика.
Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1; 2 и 5 мл; пробирки, обернутые фольгой; воронки с бумажными фильтрами; воронки со стеклянным мелкопористым фильтром; водяная баня; ФЭК или спектрофотометр.
Материал. Моча, содержащая метаболиты амидопирина. Для получения мочи белым крысам внутрибрюшинно вводят раствор амидопирина из расчета 20 мг на 1 кг массы тела, затем отсаживают их в стеклянные выделительные воронки и собирают мочу в мерные цилиндры в течение 12 или 24 ч. Перед исследованием мочу фильтруют через бумажные фильтры.
Метод основан на способности 4-аминоантипирина, являющегося метаболитом амидопирина, при взаимодействии с фенолом в щелочной среде и в присутствии гексацианоферрата (III) калия образовывать соединение типа индофенола, имеющее розовую окраску.
Ход определения. В две пробирки вносят по 1,5 мл профильтрованной мочи. В первую (для определения свободного 4-аминоантипирина) приливают 0,3 мл аммиачного буфера, а во вторую (для определения суммы метаболитов, т.е. 4-аминоантипирина и N-ацетил-4-аминоантипирина) 0,3 мл соляной кислоты. Перемешивают пробы, осторожно встряхивая пробирки.
Содержимое первой пробирки через 15 мин фильтруют через бумажный фильтр; вторую пробирку закрывают пробкой, обернутой фольгой, и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, после чего сразу охлаждают пробу в воде со льдом до комнатной температуры. Охлажденный гидролизат фильтруют через мелкопористый стеклянный фильтр в другую пробирку.
Отбирают из первой пробы 0,6 мл фильтрата в чистую пробирку и добавляют последовательно 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию опытной пробы на ФЭКе (светофильтр зеленый) или на спектрофотометре при 510 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной, содержащей все компоненты, кроме фенола, который заменяется 2 мл дистиллированной воды. Полученная экстинкция (Е1) соответствует содержанию в моче 4-аминоантипирина.
К профильтрованному гидролизату второй пробы приливают 0,6 мл аммиачного буфера, смесь перемешивают и вновь профильтровывают через бумажный фильтр. Отбирают в чистую пробирку 0,8 мл прозрачного фильтрата и добавляют последовательно 0,2 мл дистиллированной воды, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия.
Содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию второй опытной пробы на ФЭКе или на спектрофотометре при тех же условиях, что и для первой пробы. Полученное значение экстинкции (Е2) соответствует содержанию в моче суммы метаболитов (4-аминоантипирин и N-ацетил-4-аминоантипирин).
Расчет. Содержание метаболитов амидопирина в моче и показатели активности ферментных систем печени, участвующих в превращении ксенобиотиков, рассчитывают по калибровочному графику. Для его построения в 5 пробирок вносят соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мл стандартного раствора 4-аминоантипирина. Затем в каждой пробирке доводят общий объем пробы до 5 мл дистиллированной водой и приливают в них по 1 мл аммиачного буфера. Содержимое перемешивают, фильтруют, отбирают в другие пробирки по 0,6 мл фильтрата и обрабатывают его так же, как и при определении свободного 4-аминоантипирина в моче (первая опытная проба). Полученные значения экстинкции соответствуют концентрации 4-аминоантипирина 5, 10, 20, 30 и 40 мкг/л (примерный калибровочный график показан на рис. 13).
По Е1 находят общее количество выделенного 4-аминоантипирина, умножая содержание его в пробе на суточный объем мочи (в мл).
По Е2 определяют аналогичным образом сумму метаболитов амидопирина, выделенных за сутки с мочой.
Относительную активность монооксигеназы печени рассчитывают в % от введенного количества амидопирина по формуле
где А — сумма метаболитов, выделенных с мочой за сутки;
В — количество введенного животному амидопирина.
Ацетилирующую активность ферментных систем организма х (в %) находят по формуле
где Е1 и Е2 — соответствующие экстинкции опытных проб.
Оформление работы. Рассчитать относительную активность ферментных систем N-деметилирования и ацетилирования у исследуемых животных и сделать вывод о практическом значении данного теста.
Практическое значение работы. Обстоятельное изучение ферментов печени, осуществляющих реакции гидроксилирования многих соединений и их конъюгацию, открывает возможности косвенной оценки активности изучения состава и соотношения метаболитов разных ксенобиотиков, поступающих в организм. Демонстративность и относительная простота выполнения позволяют использовать эти тесты не только в эксперименте, но и в клинической практике для выявления ранних нарушений различных токсических веществ, производственных факторов и различных лекарств на ферментативные системы гидроксилирования и ацетилирования ксенобиотиков в организме.
Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы в сыворотке крови по Шкурски и др. с дополнениями И.В. Бокия, М.С. Усатенко и В.Ф. Трюфанова
Реактивы. Пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор, рН 8,5*; n-нитрозодиметиланилин, 26 мкМ раствор*; н-бутанол, 0,25 М водный раствор; НАД+, свежеприготовленный раствор (3,3 мг НАД в 1 мл 0,25 М раствора бутанола).
Оборудование. Пипетки на 0,1; 1 и 2 мл; стеклянные палочки; секундомер; спектрофотометр.
Метод основан на способности алкогольдегидрогеназы (АДГ) катализировать две последовательные реакции: НАД-зависимое окисление бутанола и восстановление n-нитрозодиметиланилина с участием НАД•Н2, образовавшимся в ходе первой реакции. При этом n-нитрозодиметиланилин, имеющий в растворе интенсивно желтую окраску, обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости светопоглощения красителя, которое регистрируют на спектрофотометре при 440 нм.
Ход определения. Спектрофотометр подготавливают к работе, устанавливают рабочую длину волны на 440 нм и стрелку шкалы отсчета с помощью рукоятки на «нуль» при закрытой шторке.
В кювету спектрофотометра помещают 2 мл раствора n-нитрозодиметиланилина и 0,5 мл сыворотки крови. Против этой кюветы рукояткой «щель» устанавливают шкалу отсчета на 0,300, после чего реакцию запускают добавлением в кювету 0,1 мл раствора НАД в растворе бутанола. Смесь быстро перемешивают стеклянной палочкой. Регистрируют снижение экстинкции инкубационной среды в течение 2 мин при 25?С.
Примечание. Определение активности АДГ в каждом образце сыворотки проводят дважды, а при расхождении результатов измерения более чем на 10% — три раза. После этого вычисляют среднее значение изменения экстинкции за 1 мин.
Расчет производится по формуле
где х — активность АДГ, мкмоль/(мин•л);
320,5 — коэффициент расчета активности, выраженный в мкмолях превращенного субстрата при указанных условиях инкубации;
?Е — изменение экстинкции при 440 нм за 1 мин.
Если изменение экстинкции при 440 нм превышает 0,050 за 1 мин, то сыворотку крови следует развести натрий-фосфатным буфером в 2-4 раза. Измеренную величину активности умножить на фактор разведения.
Для определения активности АДГ рекомендуется брать свежеполученную сыворотку крови. При хранении активность фермента снижается, поэтому значение активности, измеренной после хранения, следует умножить на соответствующий коэффициент, установленный эмпирически:
источник