Методика определения копропорфиринов в моче

Порфирины способны образовывать комплексы с ионами металлов, связывающихся с атомами азота пиррольных колец. Примерами служат железопорфирины, в частности гем, входящий в состав гемоглобина, и магнийсодержащий порфирин — хлорофилл — пигмент растений, участвующий в фотосинтезе.

Превращение порфобилиногена в порфирин может происходить просто при нагревании в кислой среде (например, в кислой моче), в тканях это превращение катализируется специфическими ферментами. Все порфириногены бесцветны, тогда как все порфирины окрашены.

Копропорфирины I и III растворимы в смесях эфира и ледяной уксусной кислоты, из которых их можно экстрагировать соляной кислотой. Уропорфирины, напротив, в этих смесях нерастворимы, но частично растворимы в этилацетате, и их также можно экстрагировать соляной кислотой. Полученные солянокислые растворы при облучении ультрафиолетовым светом дают красное флюоресцентное окрашивание. Характерные полосы поглощения могут быть зарегистрированы с помощью спектрофотометра.

Последовательно образующиеся в процессе синтеза гема из δ-аминолевулиновой кислоты интермедиаты становятся все более гидрофобными. Это повышение гидрофобности отражается на распределении интермедиатов синтеза гема в составе мочи и кала. Более полярный уропорфири-ноген экскретируется преимущественно с мочой, а более гидрофобные копропорфириноген и протопорфириноген оказываются преимущественно в желчи и удаляются с калом.

Принцип метода . При реакции порфобилиногена с пара-диметиламинобензальдегидом образуется соединение красного цвета. Повышение специфичности реакции достигается добавлением ацетата натрия. Уробилиноген, производные индола, скатола и другие соединения, дающие аналогичную реакцию с пара-диметиламинобензальдегидом, удаляют экстракцией бутанолом и хлороформом, в которых порфобилиноген нерастворим.

Реактивы . 1) пара-диметиламинобензальдегид; 2) концентрированная соляная кислота; 3) реактив Эрлиха: 0,7 г пара-диметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной соляной кислоты, приливают 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла, стабилен; 4) насыщенный раствор ацетата натрия: 375 г CH₃COONa × ЗН₂O или 226 г CH₃COONa растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным, хранят его при температуре 20 °С; 5) хлороформ; 6) бутиловый спирт; 7) индикаторная бумага для измерения pH в интервале 4,0–5,0.

Постановка пробы . Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. В пробирке смешивают по 2,5 мл мочи и реактива Эрлиха, добавляют 5 мл насыщенного раствора CH₃COONa, перемешивают. Измеряют pH, который должен быть в пределах 4,0–5,0. При pH меньше 4,0 пробу подщелачивают раствором ацетата натрия.

Оценка результатов . При отсутствии развития окраски результат считается отрицательным. Если проба окрашивается в розовый или красный цвет, в пробирку добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Окрашивание хлороформа при бесцветном или слегка желтоватом верхнем слое также позволяет считать пробу отрицательной. Если окрашенным остается слой над хлороформом, то 6–8 мл из него переносят в другую пробирку, добавляют бутанол в соотношении 1 : 2 и встряхивают. При плохом разделении слоев жидкостей пробу центрифугируют. Окрашивание бутанола свидетельствует о низком содержании порфобилиногена — проба также отрицательна. Если окрашенным остается исследуемый слой, то в моче концентрация порфобилиногена выше нормальной. В норме концентрация порфобилиногена в моче — до 2 мг/л. Данным методом порфобилиноген определяется при концентрации более 6 мг/л.

Примечание : при хранении мочи более 3 ч при комнатной температуре положительная реакция может стать отрицательной, что связано с превращением порфобилиногена в порфирин в кислой среде и образованием ингибиторов реакций. При невозможности исследования мочи в первые 2 ч хранить ее необходимо в холодильнике при 4‘°С, доведя pH до 6,0–7,0. В этих условиях порфобилиноген стабилен в течение длительного времени.

Принято различать первичные и вторичные порфинурии. К первым, обычно называемым порфириями, относят группу наследственных заболеваний, для каждого из которых характерен набор экскретируемых с мочой порфиринов и их предшественников. Вторичные порфинурии возникают вследствие нарушения функций печени или кроветворных органов в результате каких-либо первичных заболеваний, например тяжелых гепатитов, интоксикаций свинцом, фосфором, алкоголем, бензолом, четыреххлористым углеродом, некоторых злокачественных опухолях и аллергических состояниях, циррозах печени и т. п. При вторичных порфинуриях в моче обнаруживаются значительные количества копропорфиринов.

У здоровых людей с мочой за сутки в норме выводится в среднем около 67 мкг копропорфиринов; на изомер I типа приходится в среднем 14 мкг/сут, на изомер III типа — 53 мкг/сут. Отклонения в этом соотношении могут служить диагностическим признаком при некоторых заболеваниях печени.

источник

Основная часть синтезируемых порфиринов эритробластов идет на образование Нв, а неиспользованные порфирины и их предшественники выделяются с мочой и калом.

Различные типы порфиринов (уро-копро-прото) образуются в зависимости от того, какими радикалами замещены атомы водорода в порфине. Названы по источнику первоначального выделения.

Порфирины в моче — преимущественно копропорфирины > уропорфирины > порфобилиноген и ДАЛК. Основной источник – печень, меньше эритронормобласты.

Порфирины в кале — копропорфирины и протопорфирины. Часть порфиринов в организме экзогенного происхождения (поступают с пищей в составе мясных продуктов, овощей, фруктов). В печени они превращаются в копропорфирины и выделяются с желчью.

Лабораторная диагностика нарушений порфиринового обмена

Исследование порфиринов в биологическом материале представляет определенные трудности в связи с небольшим содержанием, наличием различных типов и изомеров (различное расположение радикалов), определение которых требует специфических методов. Принцип — соединения, имеющие кольцо порфирина, флуоресцируют и характеризуются интенсивным поглощением на границе видимой и ультрафиолетовой областей спектра. Восстановленные формы порфиринов (порфириногены) бесцветны.

v Определение уровня порфиринов в моче

v Определение содержания порфобилиногена в моче

v Определение ДАЛК в моче

v Определение протопорфирина в эритроцитах

Определение уровня порфиринов в моче

1. Качественные – основаны на способности порфиринов в УФ давать красную флуоресценцию. В норме с мочой выделяется 0-2 мг/л (вне чувствительности метода).

2. Количественные — унифицированный метод Соулсби — основан на спектрофотометрии. Производят экстракцию порфиринов из мочи, а затем измерение оптической плотности на 3 длинах волн – 380, 402, 430нм → пересчет по креатинину.

Норма – 30,5-122 н/моль/г креатинина.

Показания: заболевания печени, Порфирии.

Определение содержания порфобилиногена в моче

Материал: свежевыделенная моча (хранение не более 2 часов при комнатной температуре) или в холодильнике при 4 0 С или -20 0 С.

Используется качественная реакция с реактивом Эрлиха (парадиметилбензальдегид в концетрированной соляной кислоте) +бутанол. Смешивают, встряхивают, отстаивают. Происходит разделения на 2 слоя. Верхний – бутанол. Внизу – водная фаза. У здоровых – окрашен бутанольный слой, у больных – водный.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Увлечёшься девушкой-вырастут хвосты, займёшься учебой-вырастут рога 9678 — | 7612 — или читать все.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Комплексное определение порфиринов (7 параметров)

Перечень тестов в составе исследования:

гексакарбоксипорфирин;
гептакарбоксипорфирин;
копропорфирин I;
копропорфирин III;
пентакарбоксипорфирин;
уропорфирин;
общий порфирин.

Порфирины мочи
Порфирины мочи — промежуточные соединения в синтезе гема, являющегося частью молекулы гемоглобина, которая осуществляет транспортировку кислорода. При нарушении синтеза гема концентрация порфиринов в моче увеличивается.

Порфирины представляют собой оранжево-красные флюоресцирующие соединения, состоящие из 4 колец пиррола, которые образуются в процессе биосинтеза гема. Они обнаруживаются во всех клетках, принимают участие в энергетическом обмене и экскретируются с мочой в небольших количествах. Повышение в моче уровня порфиринов или порфириногенов свидетельствует о нарушении биосинтеза гема, которое бывает врожденным, например, при наследственных ферментопатиях, и приобретенным, например, при заболеваниях печени и гемолитической анемии.

Определение в моче уровня отдельных порфиринов или порфириногенов позволяет выявить недостаточность отдельных ферментов, участвующих в биосинтезе гема. В некоторых случаях количественному анализу предшествует проведение качественных скрининговых тестов (для этого используют произвольно взятую пробу мочи). В случае положительных результатов исследуют суточную мочу.

Сопоставление уровней порфиринов в моче, плазме крови и кале повышает достоверность диагностики порфирий.

Порфириновые болезни
Порфирии (болезни порфириновые) — наследственные или приобретённые (как результат воздействия химических агентов) дефекты ферментов, участвующих в биосинтезе гема.

Порфирии классифицируют в зависимости от первичной локализации нарушения синтеза порфиринов:

эритропоэтическая порфирия обусловлена нарушением синтеза порфиринов эритробластами костного мозга и проявляется главным образом кожной фотосенсибилизацией (вследствие активации УФО повышенного отложения порфиринов в коже);
печёночная порфирия обусловлена нарушением синтеза порфиринов в печени и проявляется главным образом острыми неврологическими нарушениями (приступы артериальной гипертензии, колики в животе, психозы и невропатии) без кожной фотосенсибилизации. Во время приступа в плазме и моче повышается концентрация предшественников порфирина — дельта-аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена.

Показания:

анемия;
гепатиты;
отравления свинцом.

Подготовка
Накануне сдачи анализа не рекомендуется употреблять в пищу овощи и фрукты, которые могут изменить цвет мочи (свёкла, морковь, клюква и т.п.), принимать диуретики.

Утром опорожнить мочевой пузырь (эта порция мочи выливается в унитаз). Зафиксировать время мочеиспускания, например: «8:00».

Следующие 24 часа собрать всю выделенную мочу в сухую чистую ёмкость вместимостью 2–3 литра.

После завершения сбора мочи, содержимое ёмкости нужно точно измерить. На контейнере нужно указать суточный объём мочи (диурез) в миллилитрах. Например: «Диурез: 1250 мл».

Мочу обязательно тщательно перемешать и сразу же отлить 50–60 мл в стерильный контейнер с крышкой. Всю мочу, собранную за сутки, приносить не надо.

В течение всего времени сбора и до отправки, биоматериал должен храниться в холодильнике при 2–8°С. Материал должен быть доставлен в медицинский офис в день окончания сбора.

Женщинам не рекомендуется сдавать анализ мочи во время менструации.

Интерпретация результатов
В норме экскреция уропорфиринов с мочой составляет от 27 до 52 мкг/ сут (СИ: 32–63 нмоль/сут), а копропорфиринов — от 34 до 230 мкг/сут (СИ: 52–351 нмоль/сут).

Повышение в моче содержания порфиринов и их предшественников — характерный признак порфирий. Кроме того, экскреция порфиринов может возрастать при вирусном гепатите, лимфогранулематозе, поражении ЦНС, циррозе печени, а также отравлениях солями тяжёлых металлов, бензолом и четыреххлористым углеродом.

Факторы, повышающие результат:

применение барбитуратов, хлоралгидрата, хлорпропамида, сульфаниламидов, мепробамата, хлордиазепоксида — индуцирует порфирию или порфиринурию; от приема этих препаратов следует по возможности отказаться за 12 дней до проведения исследования;
прием пероральных контрацептивов, гризеофульвина (экскреция порфиринов с мочой увеличивается);
беременность или менструация (возможно повышение или снижение содержания порфиринов в моче);
применение рифампицина повышает содержание уробилиногена в моче;
нарушение биосинтеза гема на разных этапах способствует повышению в моче содержания порфиринов и их предшественников и развитию порфирий.

источник

Вид анализа, подлежащий приборному оснащению. Определение содержания копропорфиринов в моче. Критерии для выбора анализатора. Метод измерения и первичный преобразователь. Автоматизация процесса измерения флуоресценции раствора копропорфиринов.

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет

«ЛЭТИ» им. В.И. Ульянова (Ленина)

по дисциплине «Медицинские приборы, аппараты, системы и комплексы»

Тема: Определение содержания копропорфиринов в моче

Студент гр. 2081 Глушенко И.В.

Преподаватель Садыкова Е.В.

1. ВИД АНАЛИЗА, ПОДЛЕЖАЩИЙ ПРИБОРНОМУ ОСНАЩЕНИЮ

3. СТРУКТУРНАЯ СХЕМА РАЗРАБОТАННОЙ СИСТЕМЫ С ПОЗИЦИИ БТСЛА

4. КРИТЕРИИ ДЛЯ ВЫБОРА АНАЛИЗАТОРА

5. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ И ПЕРВИЧНЫЙ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЬ

6. ЦЕПЬ ВТОРИЧНЫХ ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ

7. РЕГИСТРАЦИЯ, ОТОБРАЖЕНИЕ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНФОРМАЦИИ

8. ПУТИ АВТОМАТИЗАЦИИ ПРОЦЕССА АНАЛИЗА

10. СПОСОБ ПОВЕРКИ АНАЛИЗАТОРА

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Порфирины представляют собой циклические соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанными между собой метенильными мостиками [3].

Встречающиеся в природе порфирины являются соединениями, у которых восемь атомов водорода порфиринового ядра замещены боковыми группами, строение и относительное расположение которых, определяют отличие порфиринов друг от друга рис. 1.1 [5].

Рис. 1.1 Молекулярная структура некоторых порфиринов

Изомеров копропорфиринов типа III больше чем типа I так, как биологически важные порфирины, гемоглобин, миоглобин и т.д., являются изомерами типа III.

Самый большой клинический интерес из всех порфиринов представляют копропорфирины и уропорфирины, так как при порфириях наблюдается значительное увеличение экскреции этих соединений. Экскреция копропорфирина также увеличивается при лейкозах, анемиях, заболеваниях печени, ожогах, инфекционных заболеваниях, выраженном дефиците железа, при отравлениях мышьяком, этанолом, свинцом.

Копропорфирины растворимы в смеси эфира и ледяной уксусной кислоты. Уропорфирины в этой смеси нерастворимы, но частично растворимы в этилацетате. Полученные растворы при облучении УФ дают характерное красное флуоресцентное свечение. Эти свойства копропорфиринов можно использовать для количественного определения содержания их в моче.

Максимум поглощения всех порфиринов находится около 400нм. Спектр флуоресценции сильно зависит от величины pH раствора. При pH?6 один из максимумов интенсивности флуоресценции копропорфирина III приходится на 690нм.

1. ВИД АНАЛИЗА, ПОДЛЕЖАЩИЙ ПРИБОРНОМУ ОСНАЩЕНИЮ

моча анализатор флуоресценция копропорфирин

Определение содержания копропорфиринов в моче.

Для измерения флуоресценции раствора копропорфиринов.

Область применения анализатора.

Применяется для определения концентрации компонентов биологических жидкостей и клеток, основанный на измерении интенсивности флуоресцентного излучения при оптическом воздействии на жидкую биологическую пробу с последующей обработкой результатов [1].

Биологическая. Моча человека.

Материалы и реактивы необходимые для определения содержания копропорфиринов в моче представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1 Перечень используемых материалов и реактивов при проведении анализа

источник

Комплексный количественный анализ, позволяющий определить в моче уровень уро- и копропорфиринов: уропорфирин, гептакарбоксипорфирин, гексакарбоксипорфирин, пентакарбоксипорфирин, копропорфирин I, копропорфирин III, общий порфирин. Исследование предназначено для диагностики как врождённых, так и приобретенных порфирий. В основе генетически обусловленной порфирии лежит нарушение биосинтеза гема, приводящее к избыточному накоплению в организме порфиринов и их предшественников. Вторичные порфирии возникают вследствие нарушения функций печени или кроветворных органов как результат воздействия тяжелых металлов, интоксикаций свинцом, фосфором, алкоголем, бензолом, четыреххлористым углеродом, при некоторых злокачественных опухолях и аллергических состояниях, циррозах печени и проч.

Высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС).

Нмоль/сут. (наномоль в сутки), мкмоль/сут. (микромоль в сутки).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исключить из рациона алкоголь в течение 24 часов до исследования.
Исключить (по согласованию с врачом) прием мочегонных препаратов в течение 48 часов до сбора мочи.

Общая информация об исследовании

Порфирины — циклические соединения, образованные четырьмя пиррольными кольцами, связанными между собой метенильными мостиками, синтезируются из глицина и сукцинил-CoA через образование δ-аминолевулиновой кислоты и порфобилиногена. Это промежуточные соединения в синтезе гема, являющегося частью молекулы гемоглобина, осуществляющей перенос кислорода. При нарушении синтеза гема концентрация порфиринов в моче увеличивается.

Порфирины представляют собой оранжево-красные флюоресцирующие соединения, состоящие из 4 колец пиррола, которые образуются в процессе биосинтеза гема. Они обнаруживаются во всех клетках, принимают участие в энергетическом обмене, и экскретируются с мочой в небольших количествах. Повышение в моче уровня порфиринов или порфириногенов свидетельствует о нарушении биосинтеза гема, которое бывает врождённым, например при наследственных ферментопатиях, и приобретенным, например при заболеваниях печени и гемолитической анемии.

Принято различать первичные и вторичные порфинурии. К первым, обычно называемым порфириями, относят группу наследственных заболеваний, для каждого из которых характерен набор экскретируемых с мочой порфиринов и их предшественников. Вторичные порфинурии возникают вследствие нарушения функций печени или кроветворных органов в результате каких-либо первичных заболеваний, например тяжелых гепатитов, интоксикаций свинцом, фосфором, алкоголем, бензолом, четыреххлористым углеродом, при некоторых злокачественных опухолях и аллергических состояниях, циррозах печени и т. п. При вторичных порфинуриях в моче обнаруживаются значительные количества копропорфиринов.

Измеряются семь показателей порфиринов, включая общий порфирин, что позволяет идентифицировать токсический эффект металлов и увидеть, какое лечение необходимо. Также показатели конкретных порфиринов служат функциональными маркерами токсичности ядовитых металлов и органических химических веществ. С помощью порфириновых тестов можно определить уровень биохимического повреждения, вызванного воздействием токсических веществ, ртутное воздействие у пациентов, уровень токсинов у пациентов до и во время хелатирования, токсичность лекарственных препаратов, провести дифференциальную диагностику при отравлениях тяжелыми металлами.

Действие токсинов может вызвать повышенную чувствительность к химическим веществам, поведенческие расстройства и снижение обучаемости, иммунную дисфункцию, синдром хронической усталости, неврологические и психические, эмоциональные расстройства, анемии.

Также целесообразно при определении токсичности исследовать спектр заболеваний, связанных с аутизмом (ASD), и проводить разработку лечебных мероприятий по устранению недостаточной детоксикации и сульфатации, накопления тяжелых металлов. Источниками токсинов могут быть рыба, амальгамы, загрязненный воздух и почва, флуоресцентные лампы, краски, керамика, лечение с помощью методов народной медицины, грунтовые воды, табак. Симптомы интоксикации: усталость, слабость, повышенная химическая чувствительность, раздражительность, беспокойство, потеря памяти, бессонница, онемение и покалывание в руках и ногах, судороги, желудочно-кишечные расстройства, потеря аппетита.

Когда назначается исследование?

Диагностика первичных (наследственных) порфирий;
при подозрении на интоксикацию свинцом или ртутью, органическими растворителями, лекарственными препаратами (противосудорожные, анальгетики, анестетики, антипсихотики, противовоспалительные и гормональные), а также алкоголем и его суррогатами;
болезни гепатобилиарной системы, сопровождающиеся порфиринуриями;
гормональные изменения у женщин на фоне менструального цикла с обильными выделениями;
анорексия на фоне низкокалорийной, низкоуглеводной диеты;
острые атаки в анамнезе, одновременно сочетающие в себе острую боль в животе без симптомов раздражения брюшины с выделением красной или розовой мочи, появлением нарушений сердечного ритма, тошноты и рвоты, повышением артериального давления, повышением температуры тела на фоне различных проявлений полиневропатии.

источник

Владельцы патента RU 2283036:

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики свинцовой интоксикации организма. Путем спектрофотометрии исследуют биологический материал организма. Определяют концентрацию порфирина в тканях биологического материала и сравнивают ее значения с эталонным. В качестве биологического материала используют участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводят спектрофотометрическое исследование. При этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением. Длина волны соответствует одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов. Определяют амплитуду излучения флюоресценции этого участка. В качестве эталона сравнения принимают амплитуду флюоресценции протопорфирина IX, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100 до 1500 мкг/л и более. При равенстве амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина IX в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани. При этом длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения протопорфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм. Способ позволяет существенно упростить исследование показателей, косвенно характеризующих концентрацию свинца в тканях, а следовательно, и общую степень выраженности свинцовой интоксикации у лиц с подозрением на свинцовую интоксикацию. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине, а именно — к способам экспресс-диагностики свинцовой интоксикации живых биологических тканей и организма в целом, и может быть использовано в профпатологии, токсикологии, терапии и других разделах медицины.

Известны способы определения концентрации свинца в крови и в моче, а также показателей его воздействия (копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты) лабораторными методами. Например, один из способов определения свинца в крови и моче заключается в сухом озолении пробы крови и мочи, ее растворении в индифферентном электролите и последующем полярографическом определении свинца (см. «Полярографическое определение микрограммовых количеств свинца в крови» — Павловская Н.А. и др. / Лабораторное дело, №1, 1982. — с.26-29). Для анализа отбирают 1 г крови и 20 мл мочи с гепарином, производят минерализацию биосубстратов с помощью серной и азотной кислот с последующим получением сухого остатка при нагревании на плитке с асбестовой прокладкой и дальнейшем сжигании в муфельной печи. Озоленный остаток крови растворяют соляной кислотой, а мочи фоновым раствором и производят полярографический анализ, предварительно продувая исследуемые растворы инертным газом для удаления из проб окислителей. Перед каждой серией полярографического анализа следует делать контрольную пробу на наличие свинца в реактивах.

Известен способ оценки степени выраженности свинцовой интоксикации, включающий спектрофотометрическое исследование биологического материала организма (Любченко П.Н. Особенности диспансеризации рабочих свинцовых производств / Методические рекомендации. — М.: МОНИКИ, 1985.-22 с.).

При этом производят определение уровней накопления копропорфирина и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче.

В практике лабораторного клинического анализа для определения копропорфирина часто используется метод Фишера в модификации М.И.Гусева и Ю.К.Смирнова. Экстракция копропорфирина из мочи осуществляется эфиром. Смесь мочи, уксусной кислоты и эфира встряхивают на шуттельаппарате, отделяют водную и эфирную фазы. Далее извлекают копропорфирин из эфира путем добавления соляной кислоты и встряхивания в течении 5 мин пробирки, сливая соляную кислоту в мерную пробирку, повторяя эту операцию 4-5 и более раз (до полного обесцвечивания слоя соляной кислоты). Полученный раствор фотометрируют на спектрофотометре.

Определение дельта-аминолевулиновой кислоты в моче производится с применением ионообменных смол. При этом верхний слой смолы покрывают фильтровальной бумагой, пропускают дистиллированную воду, затем заливают 1 мл мочи, которая проходит через смолу в стакан, оставляя в ионообменнике мочевину и дельта-аминолевулиновую кислоту. Мочевину удаляют пропусканием через смолу воды. Далее выделяют из смолы дельта-аминолевулиновую кислоту, применяя для этого уксуснокислый натрий и ацетатный буфер. Полученный раствор также фотометрируют на спектрофотометре.

Основными недостатками данных способов являются:

1) сложность и трудоемкость методик, большая продолжительность по времени, что затрудняет частое повторение исследований при проведении мониторинга для определения эффективности проводимой терапии;

2) невозможность использования методики для скрининга при обследовании рабочих свинцовых производств непосредственно в производственных условиях;

3) исследование содержания свинца в крови осуществляется инвазивными методами, что особенно нежелательно с учетом роста заболеваемости вирусными гепатитами и другими заболеваниями, передающимися через кровь.

Задача, поставленная авторами, заключается в устранении указанных недостатков на основе разработки простого, дешевого, неинвазивного способа диагностики, базирующегося на современной технологии спектрофотометрического флюоресцентного анализа in vivo.

Кроме того, задачей явилось также расширение функциональных возможностей способа за счет определения повышенной локальной концентрации протопорфиринов на участке ткани при нормальном уровне концентрации свинца в крови и моче и оценить степени выраженности локальной свинцовой интоксикации участка ткани, что позволит обеспечить соответствующее лечение.

Эта задача достигается тем, что в способе диагностики свинцовой интоксикации организма, включающем спектрофотометрическое исследование биологического материала организма, определение концентрации порфирина в тканях биологического материала и сравнение с эталоном, предложено в качестве биологического материала использовать участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводить спектрофотометрическое исследование, при этом воздействовать на участок низкоинтенсивным лазерным излучением, с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов, определять амплитуду излучения флюоресценции этого участка, а в качестве эталона сравнения принимать амплитуду флюоресценции протопорфирина 1X, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100 до 1500 мкг/л и более, и при равенстве амплитуд устанавливать концентрацию протопорфирина 1X в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани.

Причем длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения порфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм.

Известно, что порфирины и их различные химические соединения и производные обладают выраженными спектрами флюоресценции в диапазоне длин волн 600-800 нм (Юденфренд С. Флуоресцентный анализ в биологии и медицине. — М.: Мир, 1965). Возбуждение флюоресценции порфиринов вызывается их освещением светом с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения порфиринов (337, 370, 405, 532, 632 нм). Известно также, что такие биологические ткани, как кожа и слизистые оболочки органов, являются для оптического излучения полупрозрачными и светорассеивающими средами (Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. — Саратов: СГУ, 1998). Следовательно, при освещении биотканей оптическим излучением оно проникает внутрь ткани, взаимодействует с ее биохимической и морфологической структурой и за счет актов многократного рассеяния частично выходит наружу со стороны освещаемой поверхности, составляя так называемый поток вторичного рассеянного излучения с этой поверхности. Если внутри биологической ткани содержатся флюоресцирующие вещества, например порфирины, то вместе с потоком вторичного рассеянного излучения из биологической ткани будет выходить и поток излучения флюоресценции этих веществ. Этот поток будет отличаться от потока обычно рассеянного излучения своим характерным спектром и интенсивностью. Спектр излучения флюоресценции будет указывать на то, какие флюоресцирующие вещества вызвали эту флюоресценцию, а интенсивность излучения флюоресценции будет коррелировать с количеством флюоресцирующих веществ, содержащихся в объеме биоткани, подвергшейся освещению.

Для того чтобы по интенсивности флюоресценции можно было in vivo количественно оценить уровень накопления флюоресцирующих веществ в биоткани (в данном случае порфиринов), необходимо спектрофотометрической аппаратурой зарегистрировать амплитуду сигнала флюоресценции порфиринов живой биологической ткани и сравнить полученную амплитуду с какими-либо эталонными значениями амплитуд сигнала, соответствующих тем или иным уровням накопления порфиринов в биологической ткани.

Способ осуществляют следующим образом.

На выбранном участке ткани пациента in vivo проводят спектрофотометрическое исследование. При этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения порфиринов (337, 370, 405, 532 или 632 нм), регистрируют амплитуду выходящего из биологической ткани излучения флюоресценции и сравнивают ее с эталонной амплитудой флюоресценции протопорфиринов 1X в диапазоне концентрации 100-1500 мкг/л и >1500 мкг/л. При равенстве этих амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани — ППэр. Затем в соответствии с общепринятыми градациями степени выраженности свинцовой интоксикации (А.М.Монаенкова, О.Г.Архипова, Н.С.Сорокина и др. Клиника, диагностика, лечение, вопросы экспертизы трудоспособности и профилактика свинцовых интоксикаций / Методические рекомендации — М.: МЗ РФ, 1986. — 25 с.) определяют степень выраженности свинцовой интоксикации:

— начальная (100 мкг/л 1500 мкг/л),

где ППэр. — концентрация протопорфирина в эритроцитах крови.

Конкретный пример способа.

Больной Я., 1958 г. рожд., и/б №16007, находился в отделении профпатологии МОНИКИ с 10.09. по 16.10.2003 г. Поступил с жалобами на общую слабость, боли в руках, мышцах ног, ограничение движений, боли в животе, субфебрилитет. С 1994 г. по настоящее время работает на Подольском аккумуляторном заводе сборщиком-паяльщиком. В обязанности паяльщика входит пайка межэлементных соединений аккумуляторных батарей свинцовыми прутками с помощью газовой горелки при движении свинцовых батарей по конвейеру. Вредными производственными факторами при работе паяльщика являются свинец и его неорганические соединения, шум. Длительность времени их воздействия в смену составляет 83%. Концентрации свинца в воздухе рабочей зоны в разные годы составлял 0,307-1,5 мг/м 3 при ПДК 0,01 мг/м 3 (превышение ПДК в 30-40-55 раз). С 1997 г стало отмечаться повышение дельта-АЛК (50-80-94 мкмоль/л), появились вышеописанные жалобы, усиление которых в августе 2003 г. послужило причиной госпитализации в отделение профпатологии МОНИКИ. Объективно: Общее состояние средней тяжести. Рост 172 см. Вес 50 кг. Кожные покровы и видимые слизистые бледные. В полости рта много искусственных и сломанных зубов, коронок, на зубах — камни, свинцовая кайма отчетливо не определяется. Сила в мышцах плечевого пояса резко снижена. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. ЧД 18 в 1 мин. Тоны сердца приглушены, учащены, ЧСС 100 в 1 мин. АД 110/70 мм рт.ст. Язык обложен белым налетом. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Печень не увеличена. С-ом поколачивания отрицательный с обеих сторон. Анализы: 1) Свинец в крови 110 мкмоль/Уо (норма до 40). 2) Свинец в моче 278 мкмоль/% (норма до 40). 3) Копропорфирин в моче 1939,2 мкг/г креатинина (норма 20-80). 4) дельта-АЛК в моче 31,5 мг/г креатинина (норма до 2,5). Определение степени выраженности свинцовой интоксикации предлагаемым методом флюоресцентной спектрофотометрии in vivo на коже пальцев рук показало, что амплитуда сигнала флюоресценции находится в диапазоне концентраций протопорфирина в эритроцитах от 500 до 1500 мкг/л, что соответствует легкой степени выраженности интоксикации.

Использование данного способа в клинической практике позволит существенно упростить исследование показателей, косвенно характеризующих концентрацию свинца в тканях, а следовательно, и общую степень выраженности свинцовой интоксикации у лиц с подозрением на свинцовую интоксикацию. Данный способ позволяет в кратчайшие по времени сроки проводить необходимое динамическое наблюдение больных со свинцовой интоксикацией при назначении им этиотропной и патогенетической терапии, кроме того, возможен массовый скрининг в условиях производства при проведении профилактических медицинских осмотров. Предложенный способ также позволяет исследовать повышенную локальную концентрацию протопорфиринов в тканях при нормальном уровне концентрации свинца в крови и моче и оценивать степень выраженности локальной свинцовой интоксикации тканей.

1. Способ диагностики свинцовой интоксикации организма, включающий спектрофотометрическое исследование биологического материала организма, определение концентрации порфирина в тканях биологического материала и сравнение ее значения с эталонным, отличающийся тем, что в качестве биологического материала используют участок ткани на теле пациента, на котором in vivo проводят спектрофотометрическое исследование, при этом воздействуют на участок низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны, соответствующей одному из максимумов спектра поглощения протопорфиринов, определяют амплитуду излучения флюоресценции этого участка, а в качестве эталона сравнения принимают амплитуду флюоресценции протопорфирина IX, моделирующего концентрацию протопорфирина в эритроцитах крови от 100-1500 мкг/л и более, и при равенстве амплитуд устанавливают концентрацию протопорфирина IX в эритроцитах крови исследуемой биологической ткани.

2. Способ диагностики свинцовой интоксикации организма по п.1, отличающийся тем, что длины волн, соответствующие максимумам спектра поглощения протопорфиринов, составляют 337, 370, 405, 532, 632 нм.

источник

Описание методов лабораторных исследований лиц, подлежащих периодическим медицинским осмотрам и наблюдению профпатологов, рассеяны по ряду руководств, монографий, журналов, и поэтому пользование ими в практике лабораторных работников периферических поликлиник и медсанчастей затруднено. Вместе с тем нужда хотя бы в краткой сводке таких методов велика. В Методических рекомендациях приводится описание наиболее употребительных, апробированных методик, часть из которых разработаны или модифицированы в лаборатории Ленинградского НИИ гигиены труда и профессиональных заболеваний, другие заимствованы из различных источников и хорошо зарекомендовали себя в практике нашей и других лабораторий. Опыт показал, что чувствительность, точность и воспроизводимость рекомендуемых методов достаточны для решения большинства вопросов, возникающих в повседневной практике профпатологов.

При решении вопросов диагностики профессиональных болезней помимо общих применяется ряд специальных гематологических и биохимических анализов.

Поскольку признаки поражения системы крови встречаются в практике весьма часто, а при хронических отравлениях бензолом, веществами бензольного ряда, свинцом, гемическими ядами и при воздействии ряда факторов физической природы могут являться ведущими симптомами заболевания, гематологическое исследование имеет важное значение.

Проявления токсических поражений системы крови имеют ряд особенностей, связанных с характером, структурой и степенью воздействия этиологического фактора. Однако в ряде случаев можно наблюдать однотипные изменения при воздействии различных токсических веществ и, наоборот, значительную вариабельность их при действии одного и того же фактора.

В связи с большой лабильностью и реактивностью системы крови при проведении исследований необходимо учитывать условия, которые могут повлиять на результаты. Рекомендуется проводить все исследования утром натощак, т.к. известно, что в течение суток возможны колебания показателей морфологического и биохимического состава крови, часть из которых связана с приемами пищи.

При оценке результатов исследования крови следует использовать

сопоставление с нормой, выработанной на основании обследования

контингентов здоровых людей. Оценку степени отклонений показателей

отдельных лиц проводят в сопоставлении с величинами, ограниченными

интервалом х +/- 1,5 сигмы контрольной группы (нормы). Для

выяснения общей направленности изменений крови в группе

обследуемых рабочих следует сопоставлять средние величины

изучаемых показателей обследуемой и контрольной группы.

Важным условием совершенствования практики лабораторных исследований, обеспечивающими возможность сопоставления результатов повторных осмотров и данных, полученных разными лабораториями, является использование унифицированных методик.

Обследование больших контингентов рабочих требует повышения производительности труда работников лабораторий за счет внедрения автоматических и полуавтоматических приборов и устройств. Для ускорения подсчета форменных элементов крови хорошо зарекомендовали себя ФЭК-М или ФЭКН-57, целлоскопы и другие счетчики. При систематической торировке (не реже 1 раза в 2 — 3 месяца) хорошо воспроизводимые результаты дают и эритрогемометры. Пробирочный метод счета форменных элементов крови по Н.М. Николаеву также значительно сокращает затраты времени на исследования.

Тромбоциты принимают непосредственное участие во всех звеньях процесса свертывания крови от механической защиты и образования первичного тромба на месте повреждения сосудистой стенки до выделения при их распаде прокоагулянтов, ретрактильных веществ и участия в процессах регулирования тонуса и проницаемости сосудов. Значительное снижение количества тромбоцитов имеет самостоятельное значение в происхождении некоторых форм геморрагических диатезов. Однако явления кровоточивости могут возникать и при нормальном или повышенном количестве тромбоцитов вследствие нарушения их функционального состояния.

Среди известных методов подсчета тромбоцитов принципиально различаются две группы: подсчет в мазках (метод Фонио) и подсчет в камере Горяева. В связи с распространением автоматических счетчиков форменных элементов крови определенное значение приобрел метод подсчета тромбоцитов при помощи приборов типа «Целлоскоп» и других. Величина погрешности при использовании большинства общепринятых методов велика и составляет 20 — 30% (О.Н. Пиксанов и В.П. Щенникова). Более точными и воспроизводимыми являются камерные методы; при автоматическом подсчете эритроцитов более удобным является метод Фонио.

Реактивы. Стерильный раствор сульфата магния 14%. Фиксаторы Лейшмана или Май-Грюнвальд; краситель Романовского — Гимзы.

Приготовление препарата. На проколотую и насухо вытертую кожу пальца наносят каплю раствора сульфата магния, смешивают с ней каплю крови из пальца, из смеси готовят мазки, высушивают и окрашивают по Паппенгейму.

Подсчет тромбоцитов. В окрашенном мазке сосчитывают 1000

эритроцитов и все встретившиеся при этом тромбоциты. Таким образом

получают относительное число, выражаемое промилле (промилле). Для

вычисления абсолютного количества тромбоцитов эту величину следует

умножить на количество эритроцитов в 1 мкл и разделить на 1000.

Пример: в мазках найдено 64 промилле тромбоцитов; количество

эритроцитов у пациента составляет 3,5 x 10 в 1 мкл;

отсюда число тромбоцитов в 1 мкл будет равно

Реактивы. 3,5% раствор цитрата натрия. Фурациллин. Разводящая жидкость готовится из расчета 0,025 г фурациллина на 100 мл 3,5% раствора цитрата натрия. Введение фурациллина позволяет готовить разводящую жидкость на длительное время: 1 — 2 месяца, при условии хранения в холодильнике.

Подсчет тромбоцитов. Кровь из пальца набирают в эритроцитарный меланжер до метки 0,5, разводящую жидкость — цитратно-фурациллиновую смесь — до метки 101. Подсчет ведется в 5 или 10 средних квадратах камеры Горяева, аналогично подсчету эритроцитов. Результат в абсолютных цифрах получают умножением числа тромбоцитов, найденных в камере, на 10000 или 5000.

Норма. Количество тромбоцитов у здоровых людей колеблется от

180 x 10 до 320 x 10 в 1 мкл.

Ретикулоциты, молодые эритроциты, в которых при суправитальной

окраске выявляется базофильное сетчато-нитчатое вещество.

Повышенное количество ретикулоцитов свидетельствует, как правило,

о повышенной активности эритропоэза и ускорении его темпов.

Ретикулоцитоз является симптомом большинства анемий

(железодефицитной, острой постгеморрагической, гемолитической).

Снижение числа ретикулоцитов может указывать на недостаточную

регенераторную способность кроветворения. Это относится к

гипоапластическим состояниям различного, в том числе

профессионального, происхождения (бензольная интоксикация,

хроническая лучевая болезнь), а также к анемиям, связанным с

дефицитом фактора «B — фолиевая кислота», до начала

патогенетического лечения. Клиническая оценка количества

ретикулоцитов должна быть сугубо индивидуальной. В случаях, когда

преходящий ретикулоцитоз предшествует повышению количества

эритроцитов, он является положительным прогностическим признаком.

Нарастание числа ретикулоцитов при гемолитической анемии

свидетельствует об усилении гемолиза и тем самым отражает

нарастание тяжести основного заболевания.

Ретикулоцитоз является одним из постоянных признаков хронической интоксикации свинцом.

Реактивы. Насыщенный раствор красителя блестящего крезилового синего или Азур-II на 0,9% растворе хлорида натрия (1 г красителя на 100 мл раствора NaCl). Растворение идет медленно, в тепле; к употреблению краситель готов не ранее, чем через сутки после приготовления.

Приготовление препарата. Капилляром Панченкова в небольшую пробирку вносят 15 мм красителя и 20 — мм крови из пальца, перемешивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре (время инкубации можно увеличить до 2-х часов). Из смеси готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах.

Подсчет ретикулоцитов. Рекомендуется использовать суженное поле зрения, для чего в окуляр микроскопа вкладывают диафрагму из черной бумаги с окном 4 x 4 мм. Дополнительной окраски препараты не требуют. После обнаружения первого ретикулоцита в мазке сосчитывают 1000 эритроцитов и все встретившиеся при этом ретикулоциты. Результат выражают в процентах или промилле.

Норма. У здоровых людей количество ретикулоцитов колеблется от 4 до 12 промилле.

В отличие от включений, окрашиваемых суправитально в ретикулоцитах, в отдельных эритроцитах может обнаруживаться зернистость, выявляемая после фиксации мазка крови. Считают, что эта зернистость также свойственна молодым эритроцитам, но в условиях патологии, поскольку она встречается при различных формах анемии. Большое количество базофильно-зернистых эритроцитов находят при хронической интоксикации свинцом и его неорганическими соединениями. При этом профессиональном заболевании оценка количества базофильно-зернистых эритроцитов имеет диагностическое значение. Однако и при некоторых других интоксикациях (гемические яды, бензол, сероуглерод) базофильно-зернистые эритроциты могут обнаруживаться, хотя и реже, чем при сатурнизме.

Реактивы. Этанол 96°. Основной раствор красителя: 1% водный раствор метиленового синего. Рабочий раствор готовят перед употреблением из основного (2 капли на 1 мл воды с нейтральной реакцией).

Подсчет эритроцитов с базофильной зернистостью в проходящем свете (обычная микроскопия), широко используемый в практике, имеет ряд существенных недостатков, главные из которых его трудоемкость и связанная с ней низкая воспроизводимость и сходимость результатов. Значительные преимущества метода темного поля позволяют рекомендовать последний для использования в лабораториях, проводящих исследования крови у лиц, контактирующих со свинцом. Эффект темного поля достигается путем замены обычного конденсора на «темнопольный» (выпускается ЛОМО, ОИ-13); при этом необходимо иметь осветитель с ирисной диафрагмой (типа ОИ-19 или ОИ-31) и отдельный микроскоп. В иммерсионный объектив вкладывают конусную диафрагму, имеющуюся в комплекте ОИ-13. При работе с современными микроскопами (МБИ, БИОЛАМ) для достижения эффекта темного поля следует удалить винт-ограничитель, расположенный на кремальере конденсора (под предметным столиком). Необходимы тонкие предметные стекла для мазков (не более 1 мм в толщину).

Установку освещения следует производить по методу Келлера, который сводится к следующему:

1. Выбирают окуляр 7 или 10 и наименьший объектив 8 .

2. На верхнюю линзу конденсора (или на оборотную сторону предметного стекла с мазком) наносят каплю иммерсионного масла. Устанавливают предметное стекло на столик микроскопа.

3. Поднимают конденсор (ОИ-13) до соприкосновения с каплей масла.

4. При закрытой диафрагме осветителя, поставленного на 15 — 20 см от микроскопа, направляют пучок света на плоскую сторону зеркала так, чтобы на нем появилось изображение нити накала лампы осветителя. Передвигая патрон лампы по продольной оси, добиваются максимальной резкости этого изображения. Для контроля можно положить на зеркало белую или папиросную бумагу.

5. Под визуальным контролем движениями зеркала направляют изображение нити лампы на нижнее отверстие конденсора (наблюдать при помощи простого зеркала, положенного на подставку микроскопа).

6. Приоткрывают диафрагму осветителя. При этом в поле зрения появляется светлое кольцо.

7. Фокусируют тубус микроскопа на препарат; устанавливают освещенное кольцо в центр поля зрения (при помощи центрировочных винтов конденсора); движениями конденсора вверх-вниз добиваются появления в центре поля зрения светящегося пятна на месте кольца.

8. Наносят каплю иммерсионного масла на лицевую сторону препарата и переходят к наблюдению с иммерсионным объективом. При этом в поле зрения должны быть хорошо видны светящиеся контуры эритроцитов. Базофильная зернистость выглядит в виде светящихся зерен, покрывающих весь эритроцит и не выходящих за его пределы. Характер зерен от пылевидных до грубых оскольчатых.

Подсчет. После того как найден первый базофильно-зернистый эритроцит, просматривают 40 полей зрения и подсчитывают все встретившиеся эритроциты с базофильной зернистостью (считать все эритроциты не нужно). Ответ дается в количестве базофильно-зернистых эритроцитов на 10000 (40 полей зрения по 250 эритроцитов в среднем) или в пересчете на миллион эритроцитов, для чего полученную цифру следует умножить на 100.

Норма и оценка результатов. У здоровых людей, не подвергающихся воздействию свинца и других токсических веществ, количество базофильно-зернистых эритроцитов не превышает 1000 на миллион. Для интоксикации свинцом характерны цифры 2000 и выше. При обнаружении базофильно-зернистых эритроцитов в количестве от 1000 до 1900 рекомендуется привлекать результаты повторных исследований и данные других лабораторных и клинических исследований.

Тельца Гейнца — округлые глыбкообразные образования в эритроцитах, расположенные обычно по краю и обнаруживаемые при суправитальной окраске интактных клеток или мазков крови метиловым фиолетовым, сульфатом нильского синего или блестящим крезиловым синим. Образование телец Гейнца связано с глубокими дегенеративными изменениями в цитоплазме эритроцитов, повреждением молекул гемоглобина и, в частности, денатурацией отщепившегося от них глобина; их наличие свидетельствует о глубоких функциональных нарушениях этих клеток. Обнаруживаются тельца Гейнца при воздействии ряда веществ — метгемоглобинобразователей. Исчезновение этих телец вместе с содержащими их эритроцитами происходит через несколько дней после прекращения контакта с токсическим агентом.

Реактивы. 1 г метилового фиолетового (или другого из перечисленных выше красителей) растворяют в 100 мл 0,6% раствора натрия хлорида.

Приготовление препарата. К нанесенной на предметное стекло капле крови из пальца добавляют каплю красителя. Соединенные капли перемешивают, покрывают покровным стеклом и помещают во влажную камеру на 1 — 3 часа при комнатной температуре. Микроскопируют с иммерсионным объективом.

Норма и оценка результатов. В эритроцитах здоровых людей тельца Гейнца не встречаются. При интоксикациях метгемоглобинобразователями почти в каждом поле зрения и в каждом эритроците обнаруживается 1 — 3 тельца диаметром от 0,5 до 1,5 мкм.

Гемоглобин (Hb) — заключенный в эритроцитах дыхательный

пигмент, обеспечивающий транспорт кислорода из легких в ткани и

участвующий в переносе углекислоты из тканей в легкие. Hb является

белком из группы хромопротеидов (металлопротеидов). Непременным

условием нормального функционирования Hb является пребывание в его

молекуле железа в двухвалентной форме (Fe ). Все производные Hb

обладают характерными спектрами поглощения, измерение которых

лежит в основе количественного определения их соотношений.

Основной особенностью Hb является способность образовывать

рыхлое, легко диссоциирующее соединение с кислородом, т.е.

переходить в оксигенированное состояние — оксигемоглобин (HbO ).

Карбоксигемоглобин (COHb). Помимо кислорода гемоглобин способен связывать ряд других газов и соединений, из которых в клинической токсикологии наибольшее значение имеет окись углерода (угарный газ, CO). Образующееся при этом соединение — карбоксигемоглобин — подчиняется тем же закономерностям образования и диссоциации, что и оксигемоглобин. Различие состоит в скоростях указанных процессов, и в первую очередь в скорости диссоциации. Результатом этого различия является более высокое сродство гемоглобина к окиси углерода, чем к кислороду (в 200 — 300 раз). Связанный с CO гемоглобин не может присоединять и транспортировать кислород, поэтому количество переносимого кровью кислорода уменьшается пропорционально карбоксигемоглобинемии. Развивается гипоксия. В присутствии COHb затрудняется диссоциация и молекул оксигемоглобина. Этим свойством COHb в значительной степени объясняются токсичность окиси углерода и эффективность кислородной терапии при отравлениях ею.

Метод основан на фотометрическом определении разницы

светопоглощения растворов HbO и COHb после денатурации их

Оборудование и реактивы. Универсальный фотометр ФМ (или

горизонтальный). Раствор аммиака 0,04%. Растворы едкого калия и

Определение. В две пробирки наливают по 4,9 и 5,9 мл 0,04%

раствора аммиака, после чего в каждую из них вносят по 0,1 мл

крови. В первую пробирку, предназначенную для определения

светопоглощения исходной денатурированной крови, содержащей

искомое количество COHb и HbO , быстро добавляют 5 мл раствора

щелочи, быстро перемешивают пробу двукратным опрокидыванием на

пробку и фотометрируют через минуту после внесения щелочи (50 — 70

сек., не более!) при светофильтре N 5 (М-55 или М-52, эффективная

длина волны пропускаемого света 550 или 520 ммк). Содержимое

второй пробирки, в которой определяют общее количество

гемоглобина, прямо фотометрируют при светофильтре N 6 (М-50, 496

ммкм). Фотометрирование ведется по общепринятым правилам в кюветах

10 мм против дистиллированной воды.

При использовании светофильтра N 5 (М-55) содержание COHb

E денатурированного HbO + COHb

Если светофильтр имеет марку М-52, а не М-55, то коэффициент

Пример расчета. Среднее из пяти отсчетов значение величины E

денатурированного HbO + COHb равно 0,46: E общего Hb = 0,70;

% COHb = ———- — 81 = 132 x 0,66 — 81 = 6%.

Методические замечания. Предлагаемый метод сравнительно прост, быстр и не нуждается в использовании дефицитных приборов. При хранении проб в темноте, в закрытых пробирках, фотометрирование без ущерба для точности результата может быть проведено через несколько часов после взятия крови. Приведенная формула применима только при фотометрировании на указанных приборах. Использование фотоэлектроколориметров из-за широкополосности находящихся в них светофильтров не рекомендуется, т.к. чувствительность метода при этом падает в 2 — 3 раза, а ошибка определения соответственно возрастает. Определение COHb может проводиться также по одному из вариантов спектрофотометрического метода.

Норма и оценка результатов. В крови лиц, профессионально не соприкасающихся с окисью углерода, некоторое количество COHb присутствует и обусловлено практически постоянным загрязнением атмосферы продуктами неполного сгорания всех видов топлива. По данным ЛНИИ гигиены труда и профессиональных заболеваний у городских жителей, не связанных с воздействием CO на производстве, в крови содержится 2 — 15%, а по указаниям П.А. Розенберг и Н.П. Бялко — 0 — 12% COHb. Средняя концентрация COHb в крови колеблется, по различным данным, от 2 — 4 до 6 — 8%. Источником для образования COHb является не только экзогенная окись углерода, но и, в какой-то степени, окись углерода, образующаяся в результате неполного окисления ряда продуктов обмена в организме, в частности самого гемоглобина.

Установлено, что легкой форме острой интоксикации окисью углерода соответствует в среднем 20%, средней — 30% и тяжелой — 35 — 50% COHb. Отравление, при котором содержание COHb превышает 50%, заканчивается обычно смертью.

При вынесении пострадавшего в чистую атмосферу и при вдыхании кислорода диссоциация COHb протекает сравнительно быстро (за первый час концентрация COHb уменьшается вдвое), поэтому результаты лабораторного исследования крови, взятой после оказания пострадавшему первой помощи, могут дать искаженное представление о начальной максимальной концентрации COHb, и тем самым — клинической тяжести интоксикации. В связи с этим необходимо максимально сокращать интервал между оказанием первой помощи и взятием крови для определения COHb.

При хронической интоксикации окисью углерода скорость диссоциации COHb в крови значительно уменьшается.

Метгемоглобин (гемоглобин, MtHb). При воздействии на организм

окислителей как неорганических (перекиси, нитриты,

марганцевокислый калий, бертолетова соль и др.), так и некоторых

органических веществ (нитро- и аминопроизводные бензола, анилин и

его производные и др.) происходит истинное окисление входящих в

молекулу гемоглобина атомов железа (Fe — Fe ). В результате

образуется метгемоглобин, не способный легко отщеплять кислород,

т.е. участвовать в его транспорте. Помимо прямого выключения части

гемоглобина из функционирования метгемоглобин ведет к ухудшению

отдачи кислорода остальной, неблокированной частью гемоглобина.

Следствием этого процесса является гипоксия, пропорциональная

содержанию метгемоглобина. Тяжесть интоксикации тем выше, чем

меньше исходное содержание общего гемоглобина в крови.

При отравлениях метгемоглобинобразователями в связи с наличием в организме ряда ферментных и неферментных систем происходит спонтанное восстановление гемоглобина. Оно осуществляется в присутствии глюкозы, глутатиона, молочной пировиноградной и аскорбиновой кислот, ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, метгемоглобинредуктазы и др. Непрерывное функционирование этой системы объясняется тем, что из кишечника и тканей в кровоток постоянно поступают различные продукты обмена, способные вызывать образование MtHb. Не менее существенно прямое окисляющее действие самого кислорода. При выпадении какого-либо из звеньев восстанавливающей системы (эссенциальная метгемоглобинемия) в крови в остальном вполне здоровых людей может присутствовать MtHb в количестве до 40%. Другой, так же редко встречающейся причиной метгемоглобинемии является наличие в крови гемоглобина M.

Метод основан на фотометрическом определении разницы светопоглощения растворов окси- и метгемоглобина.

Оборудование и реактивы. Универсальный фотометр ФМ или горизонтальный фотометр. Раствор аммиака 0,04%. Свежеприготовленный насыщенный раствор красной кровяной соли.

Определение. В две пробирки наливают по 3,5 и 7,3 мл раствора аммиака и в каждую из них вносят по 0,2 мл крови. Во вторую пробирку, предназначенную для определения общего гемоглобина, добавляют одну каплю раствора красной кровяной соли (перевод всего гемоглобина в метгемоглобин) и оставляют пробу на 1 час для завершения реакции. Через час фотометрируют обе пробы в кюветах 10 мм против дистиллированной воды при светофильтре N 3 (М-61, эффективная длина волны 619 мкм). Содержание метгемоглобина вычисляют по формуле:

Пример расчета: среднее из пяти отсчетов значение E

исследуемой пробы (HbO + MtHb) равно 0,30; E общего Hb = 0,70;

отсюда % MHb = 59 x —— — 18 = 7%.

Методические замечания. Предлагаемый метод прост, быстр, не требует дефицитных приборов и реактивов. Численные коэффициенты в расчетной формуле требуют периодической проверки и коррекции. Остальные указания — см. «Карбоксигемоглобин».

Норма и оценка результатов. У здоровых людей содержание MtHb в крови не превышает 1 — 3%. Легкая форма острого отравления метгемоглобинобразователями сопровождается повышением содержания MtHb в крови до 20%; средняя — до 30 — 35%; тяжелая — до 50%. Перевод 50 — 60% общего гемоглобина в метгемоглобин ведет, как правило, к смертельному исходу.

Уробилин — продукт самоокисления бесцветного пигмента уробилиногена, содержащегося в свежевыпущенной моче, является вторично всосавшимся в кровоток билирубином. Уробилин обладает специфическим спектром поглощения и характерной зеленой флуоресценцией в ультрафиолетовом свете. Последнее лежит в основе методов его определения.

Оборудование. Люминесцентная установка для определения витаминов в моче, или ЛЮМ-1, ЛЮМ-2, «Ультрасвет», или любой другой источник ультрафиолетового излучения.

Определение. Пробирку, содержащую 5 — 6 мл профильтрованной мочи, облучают ультрафиолетом в затемненном помещении. При нормальном содержании уробилина свечение мочи голубое (реакция отрицательная). При повышенном содержании уробилина появляется зеленая флуоресценция различной интенсивности. Различают слабоположительную реакцию при бледно-зеленой флуоресценции (+); положительную реакцию при хорошо выраженной флуоресценции (++) и резкоположительную реакцию при интенсивной флуоресценции зеленого цвета (+++).

Методические замечания. Предлагаемый полуколичественный метод прост и быстр. Как правило, другие компоненты мочи не мешают определению. Для ориентировочной оценки результаты полуколичественного определения вполне достаточны. Для точного количественного определения может быть использован спектрофотометрический метод.

Норма и оценка результатов. За сутки здоровый человек выводит с мочой 3 — 6 мг уробилина (уробилиногена). Выведение больших количеств свидетельствует о недостаточности печени (частичной потере способности печеночных клеток извлекать этот пигмент из крови воротной вены). При некоторых интоксикациях (ртутью, марганцем, мышьяком, фосфором, кадмием, фтором, галогенозамещенными углеводородами жирного ряда — нафталинами, фенолом, хлоропреном) содержание уробилина в моче повышается, что при сопоставлении с результатами других функциональных проб печени позволяет судить о характере и степени ее поражения.

Гематопорфирин — смесь пигментов, не содержащих железа предшественников гемоглобина в процессе его синтеза. Основным компонентом гематопорфирина является копропорфирин III. Растворы гематопорфирина обладают специфическим спектром поглощения и характерной красной флуоресценцией в ультрафиолетовом свете, что лежит в основе методов его определения.

Определение основано на визуальной оценке цвета и интенсивности флуоресценции при облучении гематопорфирина, содержащегося в моче, ультрафиолетовым светом.

Оборудование и реактивы. Любой источник ультрафиолетового излучения (см. «Уробилин»), снабженный фильтром Вуда (светофильтры УФС-2 или УФС-3). Уксусная кислота, 6 н. раствор; перекись водорода, 3% раствор (не стоек); эфир наркозный.

Определение. К 10 мл свежесобранной мочи (или хранившейся в темноте не более 8 — 10 часов) в обычной пробирке добавляют 0,5 мл уксусной кислоты, 1 — 2 капли перекиси водорода и 1,5 мл эфира. Пробирку закрывают пробкой и встряхивают. Образовавшуюся пену освещают 2 — 3 минуты ультрафиолетовым светом. При отсутствии гематопорфирина пена бесцветна или окрашена в голубой цвет. В присутствии гематопорфирина пена приобретает различной интенсивности красную окраску.

Методические замечания. Предлагаемый метод прост и быстр. Для ориентировочной оценки получаемые результаты вполне достаточны. Для точного количественного определения содержания копропорфирина в моче может быть рекомендован спектрофотометрический метод (П.А. Розенберг, Н.К. Бялко).

Норма и оценка результатов. В норме за сутки с мочой выводится около 120 мкг гематопорфирина. Оценка его количества по цвету флуоресценции производится следующим образом: бледное розовое или фиолетово-розовое окрашивание пены говорит об отсутствии гематопорфирина или содержании его в пределах нормы. Развитие розовой, ярко-розовой, бледно-красной или ярко-красной флуоресценции свидетельствует о повышенном выведении гематопорфирина и выражается в системе баллов (соответственно: -, +, ++, +++, ++++) или словесно (реакция отрицательная, слабоположительная, положительная, резко положительная).

При некоторых интоксикациях (ртутью, мышьяком, сульфаниламидами и, главным образом, свинцом) гематопорфирин выводится мочой в значительных количествах. Ценность определения гематопорфирина при диагностике сатурнизма и носительстве свинца весьма велика, так как повышение его количества встречается чаще, чем увеличение циркуляции свинца в крови и экскреции его с мочой. Однако прямого параллелизма между уровнем экскреции порфиринов и тяжестью интоксикации свинцом нет. При дифференциальной диагностике сатурнизма необходимо учитывать, что повышение количества порфиринов в моче может наблюдаться при тяжелых анемиях различной этиологии, при некоторых заболеваниях печени, авитаминозах и, в особенности, при эссенциальной порфирии — врожденном или приобретенном хроническом заболевании, одним из ведущих симптомов которого является нарушение синтеза гема.

Дельта-аминолевулиновая кислота (АЛК) — один из промежуточных продуктов синтеза гема в эритроцитах, в норме практически не экскретируется с мочой. Особенностью токсического воздействия свинца является специфическое торможение образования гема на стадии АЛК, накопление и усиленное выведение ее с мочой.

Метод основан на хроматографическом выделении АЛК из мочи на ионообменной смоле, последующей элюции и колориметрии образовавшегося после прибавления ацетил-ацетона и парадиметиламинобензальдегида окрашенного соединения.

Оборудование и реактивы. Хроматографические стеклянные колонки

диаметром 7 и высотой 300 мм. Ионообменная смола ДАУЭКС 50 x 8 или

КУ-2 (240 — 400 меш). Ацетат натрия, 0,5 М раствор. Едкий натр, 2

н. раствор. Соляная кислота 4,2 н. и 1 н. растворы. Уксусная

кислота ледяная. Хлорная кислота 70% раствор. Ацетил-ацетон.

Ацетатный буфер с pH 4,6: в литровую колбу вносят 136 мл натрия

ацетата — CH COONa x 3H O, 57 мл ледяной уксусной кислоты и

доводят объем дистиллированной водой до метки. Реактив Эрлиха II:

0,3 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 9 мл ледяной

уксусной кислоты, добавляют 2,4 мл 70% хлорной кислоты и доводят

объем ледяной уксусной кислотой до 15 мл. Реактив неустойчив и

годен к употреблению в течение 6 часов.

Подготовка хроматографической колонки. На дно колонок помещают небольшие ватные пробки. Заливают в колонки взвесь ионообменной смолы через слой воды так, чтобы над ватной пробкой образовался слой смолы высотой 2 — 3 см. Поверхность смолы накрывают кружком фильтровальной бумаги и промывают колонку 25 мл дистиллированной воды.

Подготовка смолы. Смолу многократно взмучивают в дистиллированной воде. После осаждения крупных частиц надосадочную жидкость отсасывают или декантируют. Затем смолу заливают на 20 ч двойным объемом 2 н. раствора едкого натра, периодически встряхивая. Далее смолу промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции и обрабатывают последовательно одним объемом 4 н. и шестью объемами 2 н. раствора соляной кислоты. Хранят смолу в закрытом сосуде в 1 н. растворе соляной кислоты при комнатной температуре.

Определение. Рекомендуется анализировать свежесобранную мочу. 1 мл мочи с pH 4 — 7 вносят в хроматографическую колонку и пропускают через нее со скоростью 5 — 6 капель в мин. Затем колонку отмывают от мочевины, пропуская через нее 40 мл дистиллированной воды и 3 мл 0,5 М раствора ацетата натрия с той же скоростью. Промывную жидкость выбрасывают. Далее под колонку подставляют центрифужную пробирку емкостью 10 мл и пропускают через колонку еще 7 мл раствора ацетата натрия и 1 мл ацетатного буфера с pH 4,6. В полученный элюат вносят 0,2 мл ацетил-ацетона и доводят объем до 10 мл ацетатным буфером. Параллельно готовят контрольную пробу, для чего в такую же пробирку вносят 7 мл ацетата натрия, 0,2 мл ацетил-ацетона и доводят объем смеси до 10 мл ацетатным буфером. Обе пробирки закрывают притертыми пробками, кипятят в водяной бане 10 мин. и охлаждают под струей воды до комнатной температуры. По 2 мл жидкости из обеих пробирок переносят в другие пробирки и в каждую из них добавляют по 2 мл реактива Эрлиха II. В зависимости от концентрации АЛК в пробе раствор в пробирке, содержащей исследуемую мочу (элюат), приобретает желтую, желтовато-розовую, красную или темно-красную окраску.

Норма и оценка результатов. Наиболее простой способ оценки концентрации АЛК — визуальный. Два первых оттенка указывают на отсутствие АЛК в исследуемой моче или наличие ее в количествах, не превышающих норму. Наличие других окрасок указывает на повышенное выведение АЛК. Результат может быть выражен в системе баллов (0, 1, 2, 3 и 4) или словесно (содержание АЛК: «в пределах нормы», «незначительно повышено», «повышено», «значительно повышено»). Для точного количественного определения может быть рекомендован спектрофотометрический метод.

Повышенная экскреция АЛК является одним из наиболее ранних и достоверных лабораторных признаков сатурнизма. Частота обнаружения этого признака при токсическом воздействии свинца выше, чем частота повышенной экскреции гематопорфирина, свинца, циркуляции свинца в крови, а также базофильной зернистости эритроцитов. Особенно ценно определение АЛК в качестве экспозиционного теста при массовых медицинских осмотрах рабочих и при гигиенических исследованиях.

Метод основан на концентрировании свинца в результате его соосаждения с образующимся в анализируемой пробе мочи углекислым кальцием и нефело-колориметрическом определении в форме окрашенной коллоидной мути сульфида свинца.

Оборудование и реактивы. Вытяжной шкаф. Центрифуга на 3000

об./мин. Водоструйный насос. Песчаная баня. Электроплитки. Соляная

кислота, разведенная 1:1. Азотная кислота концентрированная. Едкий

натр, 30% раствор. Бумага лакмусовая. Хлорида кальция 1 н.

раствор, очищенный частичным соосаждением (219 г CaCl x 6H O или

111 г CaCl растворяют в 700 мл воды; отдельно растворяют 143 г

Na CO x 10H O или 53 г Na CO в 300 мл воды; оба раствора сливают

при постоянном помешивании и после отстаивания декантируют

прозрачный надосадочный слой жидкости в специальную бутыль).

Карбоната натрия 0,5 н. раствор, очищенный частичным соосаждением

(143 г Na CO x 10H O или 53 г Na CO растворяют в 700 мл воды;

отдельно растворяют 30 г CaCl x 76H O или 15 г CaCl в 300 мл

воды; оба раствора сливают при постоянном помешивании и после

отстаивания декантируют прозрачный надосадочный слой жидкости в

специальную бутыль). Пергидроль (30% раствор перекиси водорода).

Цитрата натрия трехзамещенного 50% раствор. Лимонной кислоты хч

60% раствор. Тиосульфата натрия 40% раствор. Раствор Селена (смесь

равных количеств насыщенных растворов буры и борной кислоты).

Глицеринсульфидный реактив (5 г сульфида натрия N S x 9H O

растворяют в смеси 30 мл глицерина и 10 мл воды; оставляют на

сутки и при необходимости фильтруют, хранят в темноте в плотно

закрытой склянке). Основной стандартный раствор свинца (1,6 г

Pb(NO ) растворяют в 1 л 0,01 н. HCl; раствор стоек). Из

основного стандартного раствора свинца, каждый раз заново, готовят

рабочие растворы путем разведения в 100 или 10 раз (соответственно

содержащие 10 или 100 мкг свинца в 1 мл).

Определение неорганических соединений свинца. Не менее 500 мл безбелковой или предварительно освобожденной от белка мочи из суточного количества с помощью 1 н. раствора соляной кислоты или едкого натра доводят по лакмусу до нейтральной реакции. Несвежая моча для исследования непригодна. Присутствующие иногда в моче кристаллы мочевой кислоты в большом количестве следует растворить реактивом Селена. Нейтрализованную мочу переносят в высокую узкую склянку, приливают 4 мл раствора хлорида кальция и при постоянном помешивании, в несколько приемов, на протяжении 5 мин. прибавляют по каплям раствор карбоната натрия до появления легкой мути. Резкого помутнения следует избегать, так как в присутствии избытка карбоната натрия выпадает осадок карбоната цинка, который мешает дальнейшему определению. Исследуемую пробу оставляют для отстаивания осадка карбоната кальция и увлекаемого с ним карбоната свинца до следующего дня. Затем отсасывают водоструйным насосом или декантируют прозрачную надосадочную жидкость. Осадок количественно переносят в центрифужные пробирки, смывая со стенок посуды остатком мочи, центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают. Соединенные осадки растворяют в 2 — 3 мл концентрированной азотной кислоты, количественно с помощью нескольких мл воды переносят в маленькую колбу Кьельдаля и выпаривают досуха на песчаной бане или электроплитке. К остывшему осадку добавляют 1 — 2 мл концентрированной азотной кислоты и несколько капель пергидроля и вторично минерализуют пробу при нагревании до образования белого остатка нитрата кальция. Охлажденный сухой остаток растворяют в 5 мл соляной кислоты 1:1, количественно с помощью 5 мл цитрата натрия переносят в колориметрическую пробирку с плоским дном и притертой пробкой диаметром 15 и длиной 250 мм, подщелачивают 30% раствором едкого натра до отчетливо щелочной реакции, но не более, чем необходимо для появления легкой мути; в последнем случае осторожно, при перемешивании, добавляют несколько капель раствора лимонной кислоты до растворения мути. В пробу вносят 1,25 мл раствора тиосульфата натрия и 0,2 мл сульфидного реактива. Затем берут три одинаковых по цвету и диаметру пробирки; в две из них — 1 и 2 — поровну разливают содержимое колориметрической пробирки. Пробирку 2 центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин. Если на дне образуется плотный черный осадок — в пробе свинец имеется. В этом случае прозрачную надосадочную жидкость быстро сливают в третью пробирку и в ней подтитровывают рабочим раствором свинца при постоянном перемешивании из пипетки до уравнивания окраски содержимого пробирок 3 и 1. Сравнение ведут путем просматривания сверху вниз на белом фоне.

Отсутствие осадка после центрифугирования пробирки 2 свидетельствует о том, что свинца в пробе не содержится. В этом случае дальнейшая процедура не нужна и дается отрицательный ответ.

Расчет. Для пересчета полученного результата титрования в величину концентрации свинца в 1 л мочи необходимо количество мл рабочего раствора (содержащего 10 мкг в 1 мл), пошедшее на титрование, разделить на объем исследуемой пробы мочи в мл; умножить на 1000 для приведения к объему в 1 л; умножить на 10 для перевода мл рабочего раствора свинца в его содержание в мкг; разделить на 100 для перевода мкг в мг; умножить на 2, т.к. перед титрованием пробу делили пополам.

Пример: на титрование пробы в пробирке 3 пошло 0,2 мл рабочего раствора свинца, содержащего 10 мкг/мл. Для анализа использовано 500 мл мочи. Отсюда:

Определение общего количества свинца. При лечении сатурнизма комплексонами, в ожидании в исследуемой моче больших количеств свинца, связанного в основном в виде органических соединений, помимо определения неорганического свинца рекомендуется определять его общее количество. Предварительно необходимо разрушить все органические компоненты мочи с помощью мокрой минерализации. Для этого 5, 50 или 100 мл мочи (в зависимости от ожидаемого содержания свинца) вносят в колбу Кьельдаля и сжигают в вытяжном шкафу на электроплитке в присутствии необходимого количества концентрированной азотной кислоты и пергидроля до образования сухого белого остатка. Остаток растворяют при нагревании в 50 мл воды, нейтрализуют по лакмусу несколькими каплями 30% раствора едкого натрия, прибавляют 4 мл раствора хлорида кальция и, как описано выше, раствора соды до появления легкой мути. Далее не нуждающийся уже в минерализации осадок растворяют в 5 мл раствора соляной кислоты 1:1, количественно, с помощью 5 мл раствора цитрата натрия, переносят в колбу и нагревают до 80° для удаления углекислоты. Остывшую пробу подщелачивают по лакмусу и обрабатывают далее, как указано выше.

Обращаем внимание на то, что иногда при титровании, во избежание значительного увеличения объема пробы, следует использовать рабочий раствор свинца, содержащий 100 мкг/мл.

Пример: на титрование содержимого пробирки 3 пошло 3,15 мл рабочего раствора свинца, содержащего 100 мкг/мл. Для анализа было использовано 50 мл мочи. Отсюда:

Количество свинца, связанного в виде органических соединений, определяется по разности между содержанием общего и неорганического свинца.

В колбу со 190 мл дистиллированной воды вносят 10 мл крови и

после окончания гемолиза приливают 40 мл 5% раствора уксусной

кислоты в насыщенном растворе хлорида натрия. Подкисленный

гемолизат медленно нагревают до кипения, в результате чего свинец

отщепляется от белков и белки осаждаются. Охлажденный гемолизат

фильтруют через вату, измеряют объем фильтрата и нейтрализуют его

30% раствором едкого натра. Приливают 4 мл раствора CaCl , раствор

соды и далее обрабатывают пробу, как при определении

неорганических соединений свинца в моче. При расчете учитывают,

что для исследования используются не все 240 мл гемолизата (из 10

мл крови), а только объем фильтрата.

Методические замечания. Вся используемая посуда после обычного мытья должна споласкиваться 5% раствором азотной кислоты, а затем вторично дистиллированной водой.

Норма и оценка результатов. Отсутствие неорганического свинца или обнаружение его в пределах указанных концентраций не исключает, однако, токсического воздействия свинца. Лишь величины, лежащие выше приведенной границы нормы, позволяют подозревать интоксикацию и должны рассматриваться в комплексе с клиническими данными и результатами других лабораторных исследований больного. При отравлении свинцом и, особенно, при лечении его комплексонами концентрация свинца в моче возрастает и может достигать 1 — 10 мг/л. Верхней границей концентрации свинца в крови у здоровых людей является 1,9 — 2,4 мкмоль/л, или 0,4 — 0,5 мг/л.

Метод основан на осаждении ртути из мочи в виде протеината, колориметрическом определении после извлечения раствором Люголя в форме двойной ртутно-медной йодистой соли.

Оборудование и реактивы. Центрифуга на 3000 об./мин. Водяная баня. Водоструйный насос. Уксусная кислота, 10% раствор. Натрия хлорид хч. Лакмусовая бумага. Физиологический раствор. Белок яичный или сывороточный: разведенные в 8 раз белок куриного яйца или человеческая сыворотка (остатки от других анализов). Хранить в закупоренном сосуде на холоде и в темноте. Для продления срока хранения белка добавляют по 5 мг сухого пенициллина или стрептомицина на 50 мл раствора. Раствор Люголя N 1: в литровую колбу наливают немного воды, растворяют в ней 30 г йодида калия, затем 2,5 г йода и доводят водой объем до метки. Раствор Люголя N 2: в литровую колбу наливают немного воды, растворяют в ней 30 г йодида калия, затем 8 г йода и доводят водой до метки. Меди сульфата 10% раствор. Сульфит натрия, насыщенный при комнатной температуре раствор. Двойной раствор: в колбу наливают небольшое количество раствора меди сульфата, затем понемногу при помешивании добавляют раствор сульфита натрия до тех пор, пока образующийся вначале осадок начнет частично растворяться и жидкость приобретет зеленоватый цвет. Раствор нестоек, его готовят каждый раз заново. Стандартный раствор ртути. Основной раствор, содержащий в 1 мл 0,1 мг ртути, приготовляют растворением 0,1341 г сулемы, 0,1243 г ртути сульфата или 0,2265 йодида ртути в 1 л раствора Люголя N 1. Рабочий раствор, содержащий в 1 мл 0,01 мг ртути, готовят разведением основного раствором Люголя N 1 в 10 раз.

Определение. 500 мл мочи из суточного количества подкисляют по лакмусу уксусной кислотой до отчетливо кислой реакции; приливают к ней 5 мл раствора белка и растворяют при перемешивании 5 г сухого хлорида натрия. Подготовленную таким образом мочу погружают на 30 — 40 мин. в кипящую водяную баню. После свертывания и выпадения белка в виде хлопьев пробу оставляют до следующего дня для отстаивания осадка протеината ртути. На следующий день надосадочную жидкость сливают или отсасывают водоструйным насосом, осадок количественно с помощью остатка мочи переносят в широкие центрифужные пробирки и центрифугируют 20 мин. при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают; к соединенным осадкам в широкой пробирке, постоянно перемешивая, добавляют 10 мл раствора Люголя N 2; пробирку закрывают пробкой. Через 2 ч пробу повторно центрифугируют в течение 20 мин. 5 мл надосадочной жидкости, содержащей раствор ртути в растворе Люголя, сливают в обычную пробирку, приливают к ней 3 мл двойного раствора и пробирку встряхивают. Одновременно готовят контрольную пробу (смешивают 5 мл раствора Люголя N 1 и 3 мл двойного раствора).

Если содержащая исследуемую пробу пробирка отличается по цвету от контрольной (молочно-белой) и появляется в ней розовато-оранжевое окрашивание мути, исследуемая проба содержит ртуть. В этом случае приступают к количественному определению. Для этого в ряд пробирок вносят возрастающие количества рабочего раствора ртути (0,2; 0,4; 0,6 мл и т.д.); в каждую пробирку добавляют раствор Люголя N 1 в количестве, дополняющем объем до 5 мл (4,8; 4,6; 4,4 и т.д.). В приготовленный ряд разведений ртути добавляют по 3 мл двойного раствора и встряхивают пробирки. Пробирку с исследуемой пробой сравнивают с рядом разведений ртути. Количество ртути в ней соответствует содержанию ртути в пробирке стандартного ряда с совпадающей окраской. Полученный результат для пересчета на 1 л мочи умножают на 4.

Пример расчета: цвет пробирки с исследуемой мочой совпал с цветом пробирки, содержащей 0,4 мл рабочего раствора. Следовательно, в 500 мл мочи содержится 0,008 мг (для анализа использовано 5 из 10 мл раствора Люголя N 2), а в 1 л — 0,016 мг ртути.

Норма: у людей, профессионально не соприкасающихся с ртутью, ее содержание в моче не превышает 0,01 мг/л.

Метод основан на экстракции бензолом и фотометрировании сине-фиолетового ассоциата, образованного анионным йодидным комплексом ртути с катионом кристаллического фиолетового.

Оборудование и реактивы. Делительные воронки на 300 мл.

Центрифуга на 3000 об./мин. Фотоэлектроколориметр. Серная кислота,

выдерживающая пробу Саваля, 1,8 н. раствор (4,76 мл H SO ,

дистиллированной воды до 1 л). Калия йодида 0,1 М раствор (16,6 г

KJ на 1 л воды). Кристаллический фиолетовый, 0,001 М раствор

(0,407 г на 1 л воды), перекристаллизованный из метилового спирта.

Основной стандартный раствор ртути, содержащий 0,1 мг Hg в 1 мл;

приготовляют растворением 0,1341 г сулемы, 0,1243 г ртути сульфата

или 0,2265 г йодида ртути в 1 л раствора Люголя (30 г йодида калия

и 2,5 г йода в 1 л воды). Бензол.

Определение. В делительную воронку наливают 100 мл мочи из суточного количества, подкисляют 10-ю мл серной кислоты 1,8 н., добавляют 2 мл 0,1 М йодида калия, 1 мл 0,001 М раствора кристаллического фиолетового, 87 мл дистиллированной воды и 6 мл бензола. Содержимое воронки встряхивают 1 мин. Водную фазу (нижний слой) отбрасывают через 2 — 3 мин. Органическую фазу сливают в пробирку с пробкой, центрифугируют 10 мин. при 2000 об./мин., фотометрируют на ФЭК-56 при светофильтре N 8 в кювете толщиной 0,5 см против бензола. Результат отсчитывают по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Используется моча, из которой предварительно удалена ртуть (см. осаждение ртути в виде протеината — С.Л. Гинзбург). Декантируют надосадочную жидкость и в ней проводят определение ртути по вышеприведенной методике в 4-х пробах после добавления в каждую соответственно 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 мл рабочего стандартного раствора ртути (концентрация 10 мкг на 1 мл). По результатам определения строят график. В диапазоне концентраций от 2 до 10 мкг/мл график представляет собой прямую линию, т.е. отражает прямую зависимость между оптической плотностью исследуемого раствора и концентрацией ртути в пробе.

Пример расчета: найденное по калибровочному графику количество ртути в пробе разделить на 1000 для перевода мкг в мг, умножить на 10 для пересчета на 1 л мочи.

Е = 0,05; количество ртути в пробе = 1 мкг. Отсюда:

Метод основан на соосаждении марганца из мочи совместно с фосфатами при резком подщелачивании среды, окислении бесцветного двухвалентного марганца в окрашенную соль марганцевой кислоты и последующем фотометрировании раствора.

Оборудование и реактивы. Вытяжной шкаф, муфельная печь.

Центрифуга на 3000 об./мин. Водоструйный насос. Водяная баня.

Аммиак, 25% раствор. Серная кислота, 5 н. раствор. Фосфорная

кислота, 85% раствор. Серебра нитрата 3,4% раствор. Персульфат

аммония хч. Стандартный раствор марганца: 1 л основного раствора

содержит 5,04 MnO x 7H O или 2,74 безводного MnO (концентрация

марганца 1 мг/мл). Рабочий раствор готовят десяти-, стократным

разведением основного серной кислотой 5 н. (содержание марганца

Определение. В 500 мл мочи из суточного количества осаждают фосфаты с помощью 50 мл 25% раствора аммиака. После перемешивания пробу оставляют до следующего дня для отстаивания осадка. Надосадочную жидкость декантируют или отсасывают водоструйным насосом. Осадок количественно переносят с помощью остатка мочи в широкую центрифужную пробирку и центрифугируют 20 мин. при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок взмучивают в дистиллированной воде и снова центрифугируют. Промывание осадка повторяют до исчезновения запаха аммиака, затем растворяют его в 5 мл горячей 5 н. серной кислоты, через 30 мин. пропускают через фильтр Шотта и собирают в фарфоровую чашку для выпаривания. Фильтр дополнительно промывают в 2 мл той же кислоты и соединенные растворы выпаривают на электроплитке досуха, а затем сжигают в муфельной печи при 500 °C. Остывший белый полностью минерализованный осадок растворяют в течение 30 мин. в 1 мл горячей серной кислоты, раствор сливают в градуированную центрифужную пробирку. Фарфоровую чашку ополаскивают 1 мл 85% раствора фосфорной кислоты и переносят в ту же пробирку. Доводят объем пробы серной кислотой до 5 мл. В другую, контрольную, градуированную пробирку вносят 3,9 мл 5 н. серной кислоты и 0,1 мл рабочего раствора марганца (концентрация 0,01 мг/мл) и 0,1 мл 85% фосфорной кислоты. В обе пробирки вносят по 3 капли 3,4% серебра нитрата, по 0,3 сухого персульфата аммония и погружают на 30 мин. в кипящую водяную баню. Пробу остужают и определяют, содержится ли в ней марганец, по появлению розового окрашивания (просматривают пробу сверху вниз). Отсутствие окраски указывает на отсутствие марганца. В контрольной пробирке появляется характерное розовато-фиолетовое окрашивание; при окраске исследуемой пробы в более интенсивный, чем в контроле, цвет готовят шкалу из ряда разведений раствора марганца (аналогично приготовлению шкалы для определения ртути). Общий объем рабочего раствора марганца и серной кислоты должен быть при этом всегда равен 4 мл. Для пересчета содержания марганца в 1 л мочи полученный результат удваивают.

Норма. У здоровых людей, профессионально не соприкасающихся с марганцем, его концентрация в моче не должна превышать 0,01 мг/л.

Метод основан на потенциометрическом измерении ЭДС, зависящей от концентрации ионов фтора в моче, с помощью ионоселективного фторидного электрода. Обязательным условием является предварительная хроматографическая обработка мочи на ионообменной смоле для удаления всех органических компонентов, «отравляющих» электрод и снижающих его чувствительность.

Оборудование и реактивы. Фторидный ионоселективный электрод ЭФ У-1 (индикаторный). Хлорсеребряный или каломельный электрод сравнения. Солевой мостик (стеклянная трубка диаметром 10 мм, заполненная 1% раствором агар-агара на насыщенном растворе аммония нитрата). Регистрирующее устройство (pH-метр ЛПУ-1, соединенный с потенциометром, как «О»-индикатор, или цифровой вольтметр постоянного тока Щ-1413). Схема установки для потенциометрического измерения собирается по общеизвестным правилам. Хроматографические колонки диаметром 10 мм и высотой 500 мм, 2% раствор азотной кислоты. Ионообменная смола ЛВ-17 x 6. Основной стандартный раствор фтора (100 мг/мл: 222,22 мг NaF хч в 1 л дистиллированной воды, в полиэтиленовой посуде).

Подготовка смолы и хроматографической колонки. Один объем смолы заливают тремя объемами дистиллированной воды на 48 ч, меняя воду не реже двух раз в сутки. После последнего слива воды смолу заливают 2% раствором азотной кислоты и выдерживают в ней сутки. Смолу переносят в предварительно ополоснутую азотной кислотой хроматографическую колонку, на дно которой положен слой стеклянной ваты высотой 10 мм. Уровень загрузки колонки смолой — около 250 мм. При всех процедурах необходимо следить, чтобы над поверхностью смолы был слой жидкости не менее 10 мм. Загруженную колонку промывают 30 мл 2% раствора азотной кислоты со скоростью 25 капель в мин., затем с той же скоростью — дистиллированной водой до pH 4,4. Для загрузки одной колонки требуется около 15 г сухой смолы.

Определение. Рекомендуется анализировать свежесобранную мочу. При необходимости мочу собирают и хранят в полиэтиленовой посуде с добавлением нескольких капель фенольной воды.

10 мл мочи разводят дистиллированной водой в 5 раз, доводят pH до 5,0 добавлением 0,1 н. раствора соляной кислоты, пропускают через подготовленную колонку со скоростью около 25 капель в мин. Затем колонку промывают 50 мл дистиллированной воды и элюируют фтор пропусканием 30 мл 3% раствора нитрата кальция с той же скоростью. Первые 25 мл элюата собирают в полиэтиленовый стаканчик емкостью 30 — 50 мл. После окончания элюции колонку промывают 30 мл дистиллированной воды, 30 мл 2% раствора азотной кислоты и повторно дистиллированной водой до pH 4,4. После этого колонка пригодна для повторного использования.

В полиэтиленовый стаканчик с элюатом опускают фторидный электрод и один конец солевого мостика. Другой его конец и электрод сравнения погружают в стеклянный стаканчик, заполненный насыщенным раствором нитрата аммония. В этом растворе следует хранить электрод в нерабочем состоянии. Через 10 мин. после подключения электродов к регистрирующему устройству и помешивания стаканчика проводят отсчет показаний прибора в вольтах. Содержание фтора определяют по калибровочному графику. Найденную концентрацию умножают на 2,5 (разведение пробы при элюции).

Построение калибровочного графика. Из основного стандартного раствора фторида натрия, разбавляя его 3% раствором нитрата кальция, готовят ряд разведений с концентрацией 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 25,0, 50,0 и 100,0 мг/л фтора. На основании данных потенциометрического исследования этих растворов строят полулогарифмический график, на котором по оси ординат откладывают показания измерительного прибора (в), а по логарифмической оси абсцисс — концентрацию фтора (мг/л). Зависимость между величиной ЭДС и логарифмом концентрации фтора прямолинейная.

Норма и оценка результатов. Концентрация фтора в моче здоровых людей, профессионально не соприкасающихся с его соединениями, полученная данным методом, колеблется от 0,33 до 1,5 мг/л. Среднее содержание фтора при этом составляет 0,80 +/- 0,07 мг/л. Диагностическое значение имеют лишь величины, превышающие 1,5 мг/л (79 мкмоль/л).

Метод основан на отгонке фенола с паром из гидролизованной с помощью серной кислоты мочи, который при взаимодействии с реактивом Джиббса образует окрашенное соединение синего цвета. Количественное определение фенола проводится колориметрически.

Оборудование и реактивы. Стеклянная перегонная установка на

шлифах с внешним парообразователем. Фотоколориметр ФЭК-Н-57.

Серная кислота хч, концентрированная. Боратно-карбонатный буфер с

pH 10,5 (10,5 г Na CO x 10H O и 2,8 г безводной буры Na B O

растворяют в 0,5 л воды). Фенольный реактив Джиббса (основной

спиртовый раствор, содержащий 15 мг 2,6-дибромхинонхлоримида в 10

мл 96° спирта). Этот раствор сохраняется на холоде и в темноте

двое суток. Рабочий раствор готовят десятикратным разведением

основного бидистиллированной водой (раствор нестоек, его следует

готовить перед употреблением). Основной стандартный раствор

фенола: свежеприготовленный раствор перегнанного фенола, 500 мг/л;

рабочий раствор готовят из основного с содержанием фенола 10 мг/л.

Определение. 5 мл мочи, подкисленной 0,5 мл концентрированной серной кислоты, помещают в среднюю колбу перегонной установки и перегоняют ее содержимое с водяным паром, получаемым в парообразователе, со скоростью 5 — 10 мл/мин. Из собранных в мерный цилиндр 50 мл дистиллята 10 мл переносят в мерную колбу на 25 мл, добавляют 2,5 мл буферного раствора, 1 мл фенольного реактива Джиббса и доводят объем бидистиллированной водой до метки. Через час пробу фотометрируют при оранжево-красном светофильтре N 7 против холостой пробы, содержащей все компоненты, кроме мочи. Предварительную калибровку проводят, исходя из рабочего раствора фенола, по шкале, содержащей в 25 мл 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и т.д. мл этого раствора, 2,5 мл буферного раствора и 1 мл фенольного реактива.

Норма и оценка результатов. Фенол является нормальным продуктом обмена в организме ряда белков, поэтому в небольших количествах он всегда присутствует в крови и моче. Поскольку бензол, попавший в организм извне, в значительной мере окисляется до фенола, его экскреция с мочой возрастает. У людей, профессионально не соприкасающихся с бензолом, за сутки выводится в среднем 8,2 мг фенола. Средняя концентрация его в моче здоровых людей равна 11,3 +/- 1,0 мг/л (120 +/- 11 мкмоль/л).

Определение фенола в моче может служить в качестве коллективного экспозиционного теста, повышенные результаты которого указывают на недопустимое загрязнение воздуха рабочей зоны производственных помещений парами бензола или фенола.

Ассоциация содействует в оказании услуги в продаже лесоматериалов: дерево брус цены по выгодным ценам на постоянной основе. Лесопродукция отличного качества.

источник