Меню Рубрики

Общий белок белковые фракции в моче

Общий белок в сыворотке крови – это концентрация альбуминов и глобулинов жидкой составляющей крови в сумме, выраженная количественно. Измеряется этот показатель в гр/литр.

Белок и белковые фракции состоят из сложных аминокислот. Белки крови принимают участие в различных биохимических процессах нашего организма и служат для транспортировки питательных веществ (липидов, гормонов, пигментов, минеральных веществ и т.д.) или же лекарственных составляющих к различным органам и системам.

Также они осуществляют роль катализаторов и выполняют иммунную защиту организма. Общий белок служит для поддержания постоянной рН среды циркулирующей крови и принимает активное участие в свертывающей системе. За счет белка все компоненты крови (лейкоциты, эритроциты, тромбоциты) присутствуют в сыворотке во взвешенном состоянии. Именно белок определяет наполнение сосудистого русла.

По общему белку можно судить о состоянии гемостаза, т.к. за счет белка кровь обладает таким характеристиками как текучесть и имеет вязкую структуру. Именно от этих качеств крови зависит работа сердца и в целом сердечно-сосудистой системы.

Исследование общего белка крови относится к биохимическому анализу и является одним из главных показателей для диагностики различных заболеваний, также он включен в обязательный перечень исследований при диспансеризации для некоторых групп населения.

категория Норма /женщины Норма/ мужчины
Новорожденные 42-62 г/л 41-63 г/л
Дети до 1 года 44-79 г/л 47-70 г/л
Дети от 1 года до 4 лет 60-75 г/л 55-75 г/л
Дети от 5 лет до 7 лет 53-79 г/л 52- 79 г/л
Дети от 8 лет до 17 лет 58-77 г/л 56-79 г/л
Взрослые 22-34 года 75 — 79 г/л 82-85 г/л
Взрослые 35-59 лет 79-83 г/л 76-80 г/л
Взрослые 60-74 года 74-77 г/л 76-78 г/л
Старше 75 лет 69-77 г/л 73-78 г/л

Определяют общий белок крови в обязательном порядке при диагностике:

  • заболеваний почек, заболеваний печени
  • острых и хронических инфекционных процессов различного характера
  • ожогах, онкологических заболеваниях
  • нарушениях процессов обмена веществ, анемии
  • нарушениях питания и истощениях, заболеваниях ЖКТ — для оценки степени нарушения питания
  • ряда специфических заболеваний
  • как 1 этап в комплексном обследовании состояния здоровья пациента
  • для оценки резервов организма перед оперативным вмешательством, лечебными процедурами, приемом лекарственных препаратов, эффективности лечения и определения прогноза текущего заболевания

Показания общего белка крови позволяет оценить состояние пациента, функцию его органов и систем в работе по поддержанию правильного белкового обмена, а также определить рациональность питания. В случае отклонения от нормального значения, специалист назначит дальнейшее обследование для выявления причины заболевания, например, исследование белковых фракций, которые могут показать процентное соотношение альбуминов и глобулинов в сыворотке крови.

Отклонения от нормы могут быть:

  • Относительные отклонения связаны с изменением количества воды в циркулируемой крови, например, при инфузионных вливаниях или, наоборот, при избыточном потоотделении.
  • Абсолютные вызваны изменением скорости белкового обмена. Они могут быть вызваны патологическими процессами, влияющими на скорость синтеза и распада белков сыворотки крови или физиологическими, например беременностью.
  • Физиологические отклонения от нормы общего белка в сыворотке крови не связаны с болезнью, а могут быть вызваны приемом белковой пищи, длительным постельным режимом, беременностью, периодом лактации или изменением водной нагрузки и тяжелой физической работой.

Пониженные показатели общего белка в крови называется гипопротеинемией. Такое состояние может наблюдаться при патологических процессах, например, таких как:

  • паренхиматозные гепатиты
  • хронические кровотечения
  • анемии
  • потеря белка с мочой при болезнях почек
  • диеты, голодания, недостаточное употребление белковых продуктов
  • усиленный распад белка связанный с нарушением обменных процессов
  • интоксикации различного характера
  • лихорадки.

Отдельно следует отметить физиологические гипопротеинемии, т.е. состояния не связанные с протеканием патологических процессов (болезнью). Снижение общего белка в крови может наблюдаться:

  • в последнем триместре беременности
  • в период лактации
  • при длительных тяжелых нагрузках, например при подготовке спортсменов к соревнованиям
  • при длительной гиподинамии, например, у лежачих больных

Симптоматически снижение концентрации общего белка в крови может выражаться появлением отеков тканей. Этот симптом обычно появляется при значительном понижении общего белка, ниже 50 г/л.

Значительное повышение концентрации общего белка в крови называется гиперпротенинемией. Это состояние не может наблюдаться при нормальных физиологических процессах, а значит, развивается только при наличии патологии, при которой происходит образование патологических белков.

Например, повышение общего белка в крови может свидетельствовать о развитии инфекционного заболевания или состояния, при котором происходит обезвоживание организма (ожоги, рвота, понос и т.д.).

Повышение общего белка не может быть случайным, в этом случае рекомендуется как можно быстрее обратиться за помощью к доктору для дальнейшего обследования. Только специалист может установить причину, поставить верный диагноз и назначить эффективное лечение.

Заболевания, при которых происходит снижение и повышение общего белка в крови:

Пониженный общий белок крови Повышенный общий белок крови
  • Хирургические вмешательства
  • Опухолевые процессы
  • Заболевания печени (гепатиты, циррозы, опухоли и метастазы)
  • Гломерулонефрит
  • Заболевания ЖКТ (панкреатиты, энтероколиты)
  • Острые и хронические кровотечения
  • Ожоговая болезнь
  • Тиреотоксикоз
  • Анемии
  • Б-нь Вильсона-Коновалова (наследственность)
  • Плеврит
  • Асцит
  • Лихорадка
  • Сахарный диабет
  • Травмы и политравмы
  • Инфузионная терапия (вливание большого объема жидкости)
  • Интоксикации, отравления
  • Миеломная болезнь
  • Ревматоидный артрит
  • Хронический гепатит
  • Цирроз печени
  • Системная красная волчанка
  • Лимфоргануломатоз
  • Склеродермия
  • Обширные ожоги
  • Массивные кровотечения
  • Несахарный диабет
  • Отравления и инфекции, сопровождающие рвотой и поносом
  • Кишечная непроходимость
  • Нефрит
  • Холера
  • Сепсис
  • Злокачественные опухоли
  • Аллергии
  • Особой подготовки сдача биохимических анализов, в том числе и общего белка не требует, однако следует помнить, что сдаются они утром натощак. Предыдущий прием пищи должен быть не позднее 8-ми, а лучше 12-ти часов до процедуры.
  • За день до сдачи анализов лучше не принимать много белковой пищи
  • Не пить слишком большого количества жидкости
  • Избегать тяжелой физической нагрузки.

Все эти факторы могут повлиять на истинный результат анализа в ту или другую сторону.

источник

Любой врач знает, что человеческая плазма содержит огромное количество протеиновых образований. Во время проведения анализа выявляются все содержащиеся в крови белковые фракции. Их количество может свидетельствовать о каких-либо патологиях. В основном это заболевания, которые легко поддаются лечению. Однако бывают случаи выявления и серьезных болезней, например, злокачественных опухолей или туберкулеза.

Конечно, для того чтобы выявить белковые фракции крови, существует не один современный метод. Однако самым популярным из всех них является электрофорезный способ. Под данным исследованием понимается проведение анализа с помощью воздействия на нее электрического тока. Он сворачивает кровь и отделяет красные тельца от плазмы. Не стоит воспринимать результаты данного анализа как полноценный диагноз. Анализ на белковые фракции — это лишь дополнительная процедура, которая подтверждает ту или иную патологию.

Все исследуемые белковые фракции во время анализа можно разделить на три основных группы:

Альбумин представляет из себя самую большую фракцию человеческой плазмы. Его содержание в крови превышает 50%. Высокая концентрация вещества может указывать на заболевания печени, сердечную недостаточность, патологии желудочно-кишечного тракта. О недостатке альбумина в крови может свидетельствовать обезвоживание.

Общий белок — основной компонент крови человека. По его количеству можно определить наличие огромного количества заболеваний. Высокий показатель общего белка в организме говорит о наличии инфекционных недугов, онкологии, аутоиммунных патологий. Причинами недостатка общего белка могут служить заболевания ЖКТ, печени.

Микроальбумин в моче, а точнее повышение его содержания может говорить о наличии заболеваний почек и гипертонии. Кроме этого, он помогает выявить сахарный диабет на ранней стадии. Стоит отметить, что даже небольшое отклонение этого компонента в плазме человека говорит о возможных патологиях в его организме.

В связи с тем, что белковые фракции в биохимическом исследовании крови выявляются очень быстро, такой анализ можно назвать точным. Нормальное содержание протеиновых образований у каждого человека индивидуально. Но не только уникальность индивида влияет на содержание белковых фракций в организме. При данном исследовании еще рекомендуется учитывать и возраст больного.

Итак, у новорожденных до 1 года содержание белковых соединений варьируется от 47 до 72 г/л. Для детей от 1 года до 4 лет эта норма колеблется от 61 до 75 г/л. Содержание белка в крови у малышей в возрасте от 5 до 7 лет начинается от отметки в 57 и заканчивается 78 г/л. У больших детей и у взрослых этот показатель считается нормальным от 58 до 76 г/л. Итак, содержание альбуминов в крови должно быть следующим:

  • У детей до 14 лет — 38-54 г/л.
  • У взрослых от 14 до 60 лет — 35-50 г/л.
  • У пожилых людей, старше 60 лет — 34-48 г/л.

Если больной сдает анализы на определение уровня альбумина или общего белка в плазме, тогда на забор крови ему необходимо подойти рано утром. Завтракать запрещается. Желудок должен быть пустым на протяжении восьми часов. Больному разрешено пить лишь воду. Также за сутки до данного исследования запрещается употреблять слишком жирную или жареную пищу. Нужно отказаться от алкогольных напитков и не перегружать организм физическим трудом.

Взятие материала на микроальбумин в моче проходит гораздо сложнее. Человек в течение суток должен собирать всю выделяемую мочу в отдельную чистую емкость. Брать жидкость утром не разрешается. После полного сбора материала его необходимо принести на исследование, указав при этом свой точный рост и вес.

Существует еще ряд запретов перед сдачей анализа на белковые фракции. Расшифровка исследований будет сильно искажена, если человек не выполнит хотя бы одно из всех требований. Итак, перед непосредственной сдачей крови из вены индивиду не разрешается курить. Также стоит отложить процедуру, если накануне пациент перенес сильный стресс.

Результат биохимического анализа крови немного исказят и такие процедуры, как рентген, ультразвуковое исследование, флюорография. Взрослый за несколько недель до сдачи анализа должен прекратить любой прием лекарств, которые могут повлиять на состав крови. Новорожденному не рекомендуется сдавать анализ на определение белковых фракций в момент обострения прорезывания зубов. Хотя подобное исследование у малышей проводится крайне редко.

Если больной получил на руки результаты биохимического исследования крови, и содержание белков отличается от нормального, то сильно переживать не стоит. Важно вспомнить, были ли накануне какие-то стрессы. Если да, то необходимо попросить у врача направление на повторный анализ.

Кроме того, небольшое отклонение от нормы может наблюдаться и у определенной группы людей, например, у курильщиков, беременных женщин, индивидов, которые долгое время принимают лекарства, лиц, у которых зафиксирована повышенная температура. Исследование крови на белковые фракции стоит всегда воспринимать, всего лишь как справочную информацию, а не как диагностический метод. Однако нельзя не недооценивать показатели глобулинов в крови человека. Как раз их содержание может определять наличие конкретных патологий.

Очень часто на подобное исследование крови отправляют и здоровых людей. Это происходит, как правило, во время плановых медицинских осмотров. Но основная часть исследований проводится пациентам, у которых есть подозрения на какие-либо патологии. Очень часто на обследование попадают люди с различными хроническими или острыми заболеваниями, аутоиммунными отклонениями и патологиями печени, почек.

Также обязательное биохимическое исследование полагается пациентам, которые страдают от различных инфекционных и опухолевых (в том числе и злокачественных) заболеваний. Иногда при затяжном течении вирусных заболеваний врач также может отправить больного на анализ, указывающий содержание в крови белковых фракций.

Из-за некоторых заболеваний белковые фракции в биохимическом анализе увеличиваются или уменьшаются. Чаще всего изменения этих показателей вызывают опухолевые процессы, инфекционные заболевания и хронические патологии. К сожалению, иногда белок в плазме повышается из-за злокачественных образований. Однако не редко бывает, что отклонение от нормы альбумина или общего белка происходит из-за перенесенных человеком стрессов.

Также часто увеличение уровня белка в крови человека происходит из-за беременности. Влияет на количество фракций и заболевания печени и почек, а также прием некоторых лекарственных препаратов. Если у пациента было зафиксировано отклонение от нормы белка гамма-глобулина, то врач может предположить у него наличие гепатита, лейкоза, лимфомы, язвенного колита и прочих специфических заболеваний. При проявлении некоторых других симптомов врач может также отправить больного на исследование на ВИЧ.

Однако при сдаче анализов на белковые фракции стоит помнить еще и о том, что во время некоторых заболеваний, особенно на начальной стадии, глобулин в крови у человека может оставаться в норме. Такая аномалия обычно отмечается у 10% пациентов. Молодым родителям не стоит расстраиваться и в том случае, если у их младенца в возрасте до полугода был обнаружен пониженный уровень глобулинов в крови. У маленьких детей действительно подобное отклонение не считается патологией.

Грамотный пациент, который заботится о своем здоровье, ни в коем случае не будет самостоятельно себе ставить диагноз. Ведь белковые фракции в биохимическом анализе крови, а точнее их уровень, может свидетельствовать о чем угодно. Более того, стоит понимать, что на основании одного анализа врач не будет ставить диагноз. Сначала учитывается симптоматика в комплексе, а затем уже указывается заболевание, которым страдает пациент.

Только опытный врач знает о том, при каких патологиях возникает отклонение показателей от нормы, и какие белки отвечают за то или иное заболевание. Если больной начнет сам себе устанавливать диагноз, то это может вызвать у него паническое состояние. Также будет потеряна вера в успешное и качественное лечение.

источник

Анализ на общий белок в моче – исследование мочи на выявление уровня суммарных белковых фракций. При обнаружении протеинурии дополнительно выполняется исследование специфических белков, общий анализ крови и мочи. Результаты применяются в нефрологии, эндокринологии, кардиологии для диагностики и отслеживания эффективности терапии заболеваний почек, мочевыводящих путей и других патологий, приводящих к протеинурии. Материалом для исследования является средняя порция утренней мочи. Анализ проводится колориметрическим фотометрическим методом. Референсные значения – не выше 140 мг/л. Готовность результатов составляет не более 1 рабочего дня.

Анализ на общий белок в моче – исследование мочи на выявление уровня суммарных белковых фракций. При обнаружении протеинурии дополнительно выполняется исследование специфических белков, общий анализ крови и мочи. Результаты применяются в нефрологии, эндокринологии, кардиологии для диагностики и отслеживания эффективности терапии заболеваний почек, мочевыводящих путей и других патологий, приводящих к протеинурии. Материалом для исследования является средняя порция утренней мочи. Анализ проводится колориметрическим фотометрическим методом. Референсные значения – не выше 140 мг/л. Готовность результатов составляет не более 1 рабочего дня.

Читайте также:  Кровь в моче при запое

Общий белок в моче – биохимический показатель, который позволяет оценить функциональное состояние почек. Исследование отличается высокой чувствительностью и возможностью ранней диагностики первичных почечных патологий и нефропатий на фоне системных заболеваний. Незначительное количество белка всегда присутствует в моче, так как почечные клубочки свободно пропускают низкомолекулярные соединения, а высокомолекулярные не попадают в первичную мочу. Белковые молекулы большей частью реабсорбируются в проксимальных извитых канальцах и вновь поступают в кровоток. Основная часть экскретируемых белков представлена альбумином.

Состояние, при котором уровень общего белка в моче превышает норму, называется протеинурией. Оно не всегда является признаком патологии. Функциональная протеинурия развивается при интенсивной нагрузке на мышцы, выраженном эмоциональном напряжении, обезвоживании, острой инфекции, то есть она не связана с заболеванием почек. Кроме этого, повышенный белок в моче наблюдается при его усиленном образовании в организме. Почечные патологии сопровождает реальная протеинурия, которая может быть клубочковой или тубулярной. В первом случае оказываются поврежденными базальные мембраны клубочков, во втором нарушается реабсорбция белка в почечных канальцах. Выраженная протеинурия приводит к развитию гипоальбуминемии, проявляется внешними и внутренними отеками.

В условиях клинических лабораторий общий белок определяется в крови и в моче. При первичном исследовании мочи биоматериалом служит утренняя порция. Если результат подтверждает наличие протеинурии, то проводится дополнительный анализ порции суточной мочи. Процедура исследования выполняется методами колориметрии. Наибольшее применение анализ находит в общетерапевтической и нефрологической практике, в отдельных случаях оказывается востребованным в кардиологии и эндокринологии.

Анализ на общий белок в моче имеет несколько групп показаний. Он назначается для диагностики первичных гломерулопатий – заболеваний с преимущественным поражением клубочкового аппарата почек. К ним относятся различные формы гломерулонефрита, идиопатический нефротический синдром, мембранозная нефропатия. Основанием для выполнения исследования служат такие симптомы, как отеки нижних конечностей, отечность лица, асцит, прибавка массы тела, повышение артериального давления, микрогематурия и макрогематурия (кровь в моче), уменьшение количества мочи, повышенная утомляемость. Другим показанием для назначения анализа на общий белок в моче может стать заболевание, при котором существует риск вовлечения в патологический процесс почек: сахарный диабет, коллагеноз, амилоидоз, артериальная гипертензия и другие. Результаты позволяют определить степень поражения почек и отслеживать динамику во время лечения.

В рамках скрининговых обследований данный анализ назначается пациентам из групп риска по развитию хронической почечной недостаточности: тем, чей возраст более 50 лет, курящим, имеющим лишний вес в стадии ожирения или заболевания почек. Еще одним важным показанием для выполнения исследования общего белка в моче является прием нефротоксичных препаратов. К ним относятся аминогликозиды, амфотерицин B, цисплатин, циклоспорин, нестероидные противовоспалительные средства, ингибиторы АПФ, сульфонамиды, пенициллины, тиазидные диуретики, фуросемид и некоторые другие.

При исследовании общего белка в порции утренней мочи результат часто оказывается ложноположительным. Поэтому такой анализ выполняется повторно, при двух и более положительных результатах диагностируется протеинурия. Преимущество данного теста заключается в простоте и экономии времени при сборе биоматериала, поэтому он используется в рамках скрининга. Однако по его результатам невозможно определить степень протеинурии и наличие низкомолекулярных специфических белков, которые могут свидетельствовать об отдельных заболеваниях, например, о множественной миеломе. Для более точной и специфической диагностики на общий белок исследуется порция суточной мочи, а при необходимости выявления специфических белков выполняется электрофорез. Но даже в этом случае анализ не позволяет определить тип протеинурии и установить ее причину. Поэтому при положительном результате назначаются дополнительные лабораторные и инструментальные диагностические процедуры.

При выполнении анализа на общий белок в моче исследоваться может средняя порция утреней мочи или порция суточной мочи. Подготовка к процедуре сбора включается в себя ряд ограничений. За сутки необходимо отказаться от приема алкоголя и употребления продуктов, изменяющих цвет мочи. Об использовании любых лекарственных средств следует предупредить врача заранее – за 7-10 дней до анализа. При необходимости он временно отменит их прием. Так, использование диуретиков нужно прекратить не позднее, чем за 2 суток до начала сбора.

Перед сбором материала необходимо выполнить тщательный туалет наружных половых органов. Если назначено исследование утренней мочи, то в стерильную емкость собирается средняя порция при первом мочеиспускании после пробуждения. Сбор суточной мочи начинается со второго мочеиспускания, продолжается на протяжении 24 часов. Последняя порция – сразу после пробуждения на следующий день. Моча собирается в 2-х или 3-х литровую стерильную емкость, хранится в холодильнике (замораживать запрещено). Перед сдачей в лабораторию нужно измерить общий объем, собранный за сутки, и отделить порцию в 50-100 мл в стандартный контейнер. Уровень общего белка в моче может быть определен турбидиметрическими или колориметрическими методами. В лабораториях, как правило, моча исследуется колориметрическими методами, которые основаны на способности белков вступать в специфические реакции с образованием окрашенных комплексов. Все исследование выполняется в течение 1 рабочего дня.

При анализе мочи, собранной с утра, концентрация общего белка в норме не превышает 0,15 г/л. Если биоматериалом является порция суточной мочи, то референсные значения не превышают 0,14 г/сут в состоянии покоя и 0,3 г/сут после интенсивной физической нагрузки. Физиологическая протеинурия, которая называется еще доброкачественной, может развиться на фоне дегидратации, стресса, соблюдения белковой диеты, при интенсивных физических нагрузках. Приблизительно у 5% пациентов до 30 лет выявляется ортостатическая протеинурия – появление белка в моче после продолжительной ходьбы и/или стояния.

Основной причиной повышения уровня общего белка в моче становятся патологии почек. Высокие показатели определяются у пациентов с идиопатическим нефротическим синдромом, идиопатическим мембранозным гломерулонефритом, фокальным сегментарным гломерулярным склерозом, пиелонефритом, глюкозо-фосфат-аминовым диабетом, острым тубулоинтерстициальным нефритом и другими первичными заболеваниями. Кроме этого, поражение почек может быть вызвано сахарным диабетом, артериальной гипертонией, коллагенозом, амилоидозом, преэклампсией, уратной нефропатией, серповидно-клеточной анемией, а также приемом нефротоксичных препаратов, отравлением солями тяжелых металлов. Другой причиной повышения уровня общего белка в моче является его чрезмерное поступление в кровоток. Оно может быть вызвано множественной миеломой, макроглобулинемией Вальденстрема, гемоглобинурией при гемолизе, миоглобинурией на фоне повреждения мышц.

Кроме этого, повышение экскреции белка происходит при злокачественных новообразованиях, инфекциях мочевыводящих путей, непроходимости кишечника, гиперфункции щитовидной железы, патологиях нервной системы, травмах. Из лекарственных препаратов к повышению показателей анализа приводит аспирин, хлорпромазин, пенициллин, гидрокарбонат натрия, сульфонамиды, ацетазоламид. Ложноповышенные показатели определяются при лейкоцитурии, гематурии, а также при несоблюдении правил сбора биоматериала и попадании в него уретрального или вагинального отделяемого, спермы, кала.

Причиной снижения уровня общего белка в моче относительно изначально повышенных показателей являются адекватно проводимые лечебные мероприятия – устранение протеинурии. Уменьшение концентрации экскретируемого белка имеет диагностическое значение только при мониторинге успешности терапии, а не при первичном обследовании. Причиной ложного снижения уровня белка в моче может стать ее низкая относительная плотность, щелочная реакция, уреаза-положительная микрофлора.

Анализ на общий белок в моче широко применяется в клинической практике, позволяет на ранних этапах диагностировать наличие первичной почечной патологии и вторичной нефропатии. Если результаты исследования превышают нормативные значения, необходимо обратиться к терапевту либо к нефрологу за установлением диагноза и назначением лечения. Чтобы свести к минимуму вероятность физиологической протеинурии, нужно соблюдать правильный питьевой режим, не допуская обезвоживания, придерживаться сбалансированного питания с умеренным потреблением белковой пищи, избегать физических и эмоциональных нагрузок во время сбора мочи.

источник

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

Профессор Батюшин Михаил Михайлович — Председатель Ростовского областного общества нефрологов, заместитель директора НИИ урологии и нефрологии, Руководитель нефрологической службы ГОУ ВПО РостГМУ, заведующий отделением нефрологии клиники РостГМУ.

Бова Сергей Иванович — Заслуженный врач Российской Федерации,заведующий урологическим отделением — рентгено-ударноволнового дистанционного дробления камней почек и эндоскопических методов лечения, ГУЗ «Областная больница №2», г. Ростов-на-Дону.

Галушкин Александр Алексеевич — кандидат медицинских наук, врач-нефролог, ассистент кафедры внутренних болезней с основами физиотерапии №1 РостГМУ.

Турбеева Елизавета Андреевна — редактор страницы.

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек.

Книга: «Протеинурия» (А.С. Чиж).

Еще Гофману и Сенатору (1874) было известно, что с мочой при заболеваниях почек выделяются не только альбумины, но и глобулины (цит. по: Н.Я.Червяковский, 1963). Позже это подтвердил A.Hiller (1927), а затем Е.М.Тареев и М.А.Благирева (1931).

С введением в клиническую практику метода электрофореза белков на бумаге появилась возможность более глубоко изучить механизм протеинурии и ее особенности при различных заболеваниях почек.

По мнению А.Я.Пытеля и С.Д.Голигорского (1968), электрофорез остается пока наиболее доступным методом определения качественных особенностей протеинурии и позволяет в известной мере уточнять некоторые стороны механизма ее происхождения. Белковый состав мочи при диффузных заболеваниях почек изучался методом электрофореза на бумаге многими исследователями.

В последние годы для исследования качественных и количественных особенностей белков мочи используют предложенный в 1955 г. O.Smithies метод электрофореза в крахмальном геле. По мнению Е.М.Тареева (1968), А.Я. Лытеля и С.Д.Голигорского (1968), этот метод является перспективным не только для изучения качественных особенностей протеинурии, но и для выяснения некоторых звеньев ее патогенеза.

К сожалению, работ с применением указанного метода пока еще очень мало (Д.БЛ.Дыкин, М.М.Щерба, 1969; Д.Б.Цыкини соавт., 1971, 1972; Т.Н.Александровская, 1972; Л.Р.Полянцева, 1972; J.Traeger и соавт., 1965,1966,1967).

С помощью электрофореза белков в крахмальном геле по сравнению с электрофорезом на бумаге удается обнаружить в сыворотке крови и в моче значительно большее число белковых фракций,а следовательно,получить и более ценную информацию о белковом спектре этих биологических жидкостей при различных заболеваниях почек.

Так, Д.Б.Цыкини соавт. (1969, 1971), используя данный метод для изучения состава уропротеинов при некоторых диффузных заболеваниях почек, выявили в моче обследованных ими 52 больных от 3 до 12 белковых фракций, в том числе по три фракции (преальбумины, альбумины, сидерофилин) при хроническом гломерулонефрите с изолированным мочевым синдромом, 11 (пре- и постальбумины, альбумины, «2-быстрые глобулины, сидерофилин, гаптоглобины и у-глобулин) — при смешанной форме хронического гломерулонефрита и 12 (кроме упомянутых, еще и «2-медленные глобулины) фракций при нефротическом синдроме на почве гломерулонефрита и амилоидоза почек.

Содержание каждой из глобулиновых фракций, выраженное в относительных показателях (%), было наибольшим в моче больных с нефротическим синдромом.

Как подчеркивают авторы, содержание «2-медленных глобулинов (макроглобулинов) было весьма незначительным (1,1 ±0,71%), и белки этой фракции выявлялись только при нефротическом синдроме и то лишь в единичных случаях. Однако в работе не указывается, как часто встречались другие глобулиновые фракции, в частности гаптоглобины и у-глобулины.

Кроме того, не проведен раздельно анализ уропротеинограмм при одинаковых клинических формах острого и хронического гломерулонефрита и при нефротическом синдроме в зависимости от его этиологии. На наш взгляд, это могло бы представить определенный интерес для дифференциальной диагностики диффузных заболеваний почек.

В работах J .Traeger и соавт.,(1965, 1966, 1967), материалы которых основаны на данных обследования больных (более тысячи) с различными врожденными и приобретенными заболеваниями почек, изучен белковый спектр мочи с одновременным использованием методов электрофореза на бумаге, в крахмальном геле и иммуноэлектрофореза.

В большинстве случаев полученные данные сопоставлялись с результатами прижизненной пункционной биопсии почек и эффективностью кортикостероидной терапии. При некоторых врожденных тубулопатиях упомянутые исследователи выявили так называемый канальцевый (тубулярный) тип протеинурии, для которого на электрофореграмме в крахмальном геле характерно наличие:

  • 1) фракции преальбуминов в виде «шапки жандарма»;
  • 2) небольшой фракции альбуминов и большой постальбуминов, широкой полосы быстрых (что, по мнению Е. Butler, является специфичным для тубулярной протеинурии) и еще более широкой (шире, чем сывороточного сидерофилина) у-глобулинов;
  • 3) а2-медленных и b-глобулинов.

Тубулярный тип протеинурии в чистом виде либо с некоторыми изменениями обнаружен также при пиелонефрите, поликистозе почек, острой почечной недостаточности, отравлении фенацетином, витамином Д, при гипоксии. Однако необходимо отметить, что в упомянутых работах изучались лишь качественные особенности уропротеинограмм без их количественного анализа.

Анализируя литературные данные о качественном и количественном составе белков мочи при важнейших диффузных заболеваниях почек, следует отметить, что получены ОНИ в основном с помощью метода электрофореза на бумаге и в ряде случаев, существенно различаются между собой.

При этом наиболее исследован нефротический синдром, в меньшей мере — другие клинические формы гломерулонефрита и незначительно — пиелонефрит. Содержание в моче отдельных белковых фракций выражалось, как правило, лишь в относительных (%), а не в абсолютных (г/л) величинах, и в подавляющем большинстве результаты исследований не подвергались статистическому анализу.

Содержание общего белка, а тем более отдельных его фракций в моче, их качественные и количественные особенности в аспекте различных клинических форм важнейших диффузных почечных поражений до настоящего времени изучались весьма ограниченно.

Более полного представления о качественных и количественных особенностях уропротеинограмм при различных клинических вариантах почечных заболеваний можно достичь при помощи метода электрофореза белков в различных гелях, в частности в крахмальном геле.

Методом электрофореза в крахмальном геле нами изучен белковый спектр мочи у 288 больных от 16 до 65 лет, в том числе у 148 мужчин и 140 женщин. Среди них были 124 больных с различными клиническими формами хронического гломерулонефрита (22 — с острым гломерулонефритом с затянувшимся течением, 76 — с хроническим пиелонефритом, 9 — с интерстициальным нефритом, 3 — с амилоидозом почек, 26 — с хронической почечной недостаточностью, 21 — сострой почечной недостаточностью и 7 больных с застойной протеинурией). У части больных электрофорез белков проведен в динамике,в результате чего получено и проанализировано 336 уропротеинограмм.

Данные качественного и количественного анализа протеинограмм мочи в зависимости от нозологической формы заболевания и его клинической формы приводятся ниже.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Прежде чем перейти к изложению полученных данных и результатов их анализа, целесообразно дать краткое описание методики исследования. При этом метод электрофореза белков сыворотки крови и мочи в крахмальном геле описан более детально ввиду его меньшей известности и необходимости изложения некоторых дополнений и усовершенствований, внесенных нами при обработке этого метода.

Читайте также:  Меняется ли цвет мочи за сутки

Материалом для исследования являлись сыворотка крови и моча больных. Кровь (5—7 мм) брали из вены натощак. Получаемую после свертывания и центрифугирования сыворотку крови сливали в отдельную чистую пробирку и использовали для определения содержания общего белка, электрофореза белков и других исследований. Мочу брали у больных из утренней порции (сразу после сна), как это делали, например, М.А. Адо (1965) и другие. Предварительно ее подвергали диализу и концентрированию.

Диализ и концентрирование мочи. В литературе описаны различные методы диализа и концентрирования мочи. Так, Н.К.Лебедева и соавт. (1967), A. Afonso (1967) 10-20 мл мочи, помещенной в целлофановый мешочек, подвергали диализу вначале против водопроводной воды в течение 6 часов, а затем против дистиллированной воды в течение 16—20 часов.

Концентрирование осуществляли с помощью комнатного вентилятора до тех пор, пока в мешочке оставалось несколько капель мочи. М.П.Матвеев , Л.В.Шатунова (1969) диализ мочи проводили в целлофановых трубках против дистиллированной воды в течение двух дней,а концентрирование —в 16% растворе желатины. Дистиллированную воду в качестве диализирующей среды применяли и другие авторы (М.А.Адо, 1965; А.П. Пелещук и соавт., 1968 и др.).

Причем М.А.Адо для концентрирования мочи использовала комнатный вентилятор, добиваясь увеличения концентрации белка в 10 раз, а А.П.Пелещук и соавторы сгущение мочи проводили аналогично, но лишь в тех случаях, когда концентрация белка в моче была ниже 1 г/л. Другие рекомендуют добиваться концентрации белка в моче до 10 г/л и более (И.Тодоров, 1963; Т.Дочев, 1965).

Предложены методы диализа и концентрирования мочи в растворах высокомолекулярных веществ, например поливинилпирролидона, полиэтиленгликоля (В.Salle и соавт., 1967; J.Traeger и соавт., 1965, 1966 и др. ), гуммиарабика (И.Тодоров, 1963; Д.Дочев, 1965), а также с помощью особых фильтров под давлением, путем ультрафильтрации и т.п. (Ю.Я.Гофман, 1963; Г.В.Воскобойников, Н.Д.Сидорова, 1965; J.Traeger и соавт., 1966 и др.).

Мы проводили диализ мочи против дистиллированной воды в течение 8— 12 часов, а сгущение ее при помощи комнатного вентилятора в течение 4-6 часов, добиваясь увеличения концентрации белка в 20 раз. Для этого необходимое количество мочи (20 мл) в начале наших исследований помещали в целлофановый мешочек.

Однако в связи с рядом неудобств, связанных с приготовлением мешочков, внесением и взятием мочи из них, в дальнейшем для этих целей были использованы небольшие воронки. Широкую часть воронки обтягивали целлофаном, который в узкой ее части прочно обвязывали ниткой.

Концами последней затем подвешивали воронку к штативу (при концентрировании мочи) или к специальному приспособлению (при диализе). Исследуемую порцию мочи мерной пипеткой вводили в воронку через узкую ее часть.

Растекаясь относительно тонким слоем по целлофану, закрывающему широкую часть воронки, моча на сравнительно большой поверхности соприкасалась с ним, что способствовало более полному и быстрому проведению диализа и концентрирования.

Определение концентрации общего белка в сыворотке крови и в моче.

Содержание общего белка в сыворотке крови и в моче устанавливали биуретовым методом. Хотя этот метод определения белка был предложен давно (W.Autenriet, 1914; цит по: Л.А.Неделина и Н.А.Сентебова, 1971), однако для широкого использования его потребовались многочисленные дополнительные исследования (Л.Ф.Кельзон, 1952; Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; С.Г.Аптекарь, А.А. Покровский, 1969; G.Kingsley, 1939; R.Ardry, 1949; W.Bartosiewicz, 1956; M.Piscator, 1966 и др.).

В результате была разработана наиболее приемлемая модификация этого метода, которая в настоящее время предложена в нашей стране в качестве унифицированной методики определения общего белка в сыворотке крови (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

Биуретовый метод широко применяют и для количественного определения белка в моче (Л.Г.Смирнова, Е.А.Кост, 1960; Е.И.Кримкевич, 1972;

Н.Я.Мельман, 1972; А.П.Пелещук и соавт., 1972; A.Hiller, 1927; W.Foster и соавт., 1952 и др.). Однако предварительно моча должна быть сконцентрирована, так как при низких концентрациях белка снижается чувствительность метода (Л.А.Неделина, Н.А.Сентебова, 1971).

В наших исследованиях использована модификация метода, описанная Л.Г.Смирновой и Е.А.Кост (1960). Следует отметить, что в том количестве мочи, которое мы брали для исследований, существенной разницы в содержании общего белка не наблюдалось независимо от того, взята ли моча из суточного ее количества или из утренней порции.

У 23 обследованных больных (2 больных с острым гломерулонефритом, 12 — с хроническим гломерулонефритом, 7 — с хроническим пиелонефритом и 2 — с интерстициальным нефритом) концентрация общего белка в порции мочи, взятой для исследования из суточного ее количества и из утренней порции .соответственно была равна 0,072±.0,013 и 0,071±0,010 (Р>0,3). На уропротеинограмме выявлялось и в том и в другом случае одинаковое количество белковых фракций.

Содержание общего белка определяли у одного и того же больного одновременно в сыворотке крови и в моче (после ее диализа и концентрирования) . Для удобства дальнейших расчетов и проведения сравнительного анализа показателей общего белка и белковых фракций сыворотки крови и мочи применяли одни и те же величины (проценты и граммы на литр). Концентрацию белка в моче вычисляли по следующей формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

где X — концентрация белка в несконцентрированной моче, г/л; а — объем сконцентрированной мочи (обычно 1 мл); С — концентрация белка в сконцентрированной моче, определяемая по биуретовой реакции, г/л; А — объем мочи, взятой для концентрирования (обычно 20 мл).

Для определения концентрации белка в граммах на литр несконцентрированной мочи полученную величину умножают на 10.

Электрофорез белков в крахмальном геле. Исследованиями последних лет установлена высокая эффективность электрофоретического анализа белков при использовании в качестве поддерживающих сред различных мелкодисперсных гелей (агарового, полиакриламидного, крахмального), а также иммуноэлектрофореза.

Благодаря сравнительной простоте, доступности и высокой разрешающей способности в лабораторной практике последних лет широкое распространение получил метод электрофореза белков в крахмальном геле, который впервые был предложен в 1955 г. О.Smithies. Этот метод чаще всего используется для изучения различных белков крови, тканевых белков и некоторых ферментов.

Он позволяет выявить в сыворотке крови от 12 до 13—17—22 белковых фракций (С.М.Раппопорт, 1956; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Е.Д.Васильева, 1968; Ф.Гауровиц, 1965; Дж.Уилкинсон, 1968) ,а при использовании двухмерного электрофореза в сочетании с иммуноэлектрофорезом — до 30 фракций (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

При этом каждую из пяти фракций, получаемых при электрофорезе на бумаге, можно разделить на ряд под фракций. Так, например, си-глобулин человека удалось разделить на 8 под- фракций (Дж.Уилкинсон, R68). С помощью этого метода выделены плазменные белки, обладающие индивидуальными различиями, а также установлен ряд наследственных типов гаптоглобина, трансферрина и некоторых других белков.

Количество белковых фракций сыворотки крови, полученных с помощью электрофореза в крахмальном геле, так велико, что не все они идентифицированы, и в полной мере не установлено, какую сыворотку следует принимать за нормальную, так как у каждого здорового человека она может иметь свои индивидуальные особенности (Е.М.Саминский, 1966).

Что касается применения метода электрофореза в крахмальном геле для исследования белкового состава мочи при заболеваниях почек, то по этому вопросу в литературе имеется сравнительно немного работ (Е.М.Тареев, 1968; Д.Б.Цыкин и соавт., 1969; 1972; P.Milliez и соавт., 1960; M.Debray -Sachs, 1966; J.Traeger и соавт., 1965, 1966, 1967 и др.).

Между тем изучение качественного и количественного состава белков мочи с помощью упомянутого метода является перспективным как в отношении диагностики заболеваний почек, так и для выяснения некоторых сторон механизма протеинурии.

Метод электрофореза в крахмальном геле чаще всего используется для изучения качественного состава белков, однако в настоящее время доказана возможность применения его и для количественного определения отдельных белковых фракций, хотя при этом встречаются довольно значительные трудности, о чем будет сказано ниже.

Основные принципы и особенности метода. Поскольку трактовку результатов фракционного анализа белков сыворотки крови и мочи, полученных методом электрофореза в крахмальном геле, необходимо связывать с особенностями разделения белковых фракций при миграции их через гель, целесообразно кратко остановиться на основных принципах электрофореза белков в гелевых средах.

При электрофорезе гели в качестве поддерживающей среды обладают рядом важных особенностей и преимуществ по сравнению с другими средами. Главная особенность гелей — малые размеры их пор, которые, кроме того, могут изменяться в зависимости от концентрации геля.

По своему диаметру поры в геле можно сравнить с размером белковых макромолекул. Вот почему гель схож с молекулярным ситом, в котором скорость движения белковых молекул зависит от их размера: крупные молекулы (диаметр их равен или почти равен диаметру пор) движутся медленнее, чем мелкие, легко проникающие через гель (Э.Г.Ларский, 1971; Г.Маурер, 1971 и др.).

Таким образом, электрофоретическое разделение белков в гелях зависит не только от электрического заряда молекул, но и от их размеров и формы (Е.М.Саминский, 1966; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Хаггис и соавт., 1967). Кроме того, адсорбционные явления в гелях выражены очень слабо (Г.В.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966).

По этим причинам электрофорез в гелях обладает чрезвычайно высокой разрешающей способностью, которая наиболее выражена в крахмальном и полиакриламидном гелях. Агаровый гель, хотя и обладает малой адсорбционной способностью, но в связи с относительно большими размерами пор дает несколько худшее разделение белковых молекул (Е.М.Саминский, 1966).

Считают, что электрофорез в мелкодисперсных гелях является единственным видом электрофореза, при котором происходит разделение белков с одинаковой электрической подвижностью, но с различными молекулярными массами (В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Аппаратура и другие принадлежности, необходимые для проведения электрофореза белков в крахмальном геле. Электрофорез белков в крахмальном геле можно проводить в обычном аппарате, предназначенном для электрофореза белков на бумаге, например типа ПЭФ, но описаны и специальные аппараты для проведения этого метода исследования (В.Д.Успенская, 1959; В.М.Родионов и соавт.; 1960; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; М.Д.Луцик, 1968; S.Boyer, R.Hiner, 1963). Нами использован аппарат УЭФ (универсальный прибор для электрофореза).

Для получения определенных размеров гелевой пластинки и проведения электрофореза необходима специальная кювета с крышкой. Предложены и описаны различные варианты плексигласовых кювет (Г.В.Троицкий, 1962; И.М.Маркелов, 1964; Н.Н.Старостин, 1966; А.А.Стрекалов, 1966 и др.).

На наш взгляд, наиболее простой и удобной является конструкция кюветы, описанная В.Д.Успенской и соавт. (1968). Мы пользовались плексигласовой кюветой аналогичного типа, но несколько иных размеров: длина ее рабочей площади составляла 16,5 см, ширина 7,0 см и высота бортиков (от этого зависит толщина гелевой пластинки) 6 мм. Крышка кюветы имела те же размеры, за исключением меньшей высоты бортиков (3 мм), так как она одновременно использовалась в качестве лотка для разделения гелевой пластинки на две равные части одинаковой толщины.

Формовочная пластинка (гребенка), необходимая для образования поперечного ряда щелей в геле, куда вносится исследуемый материал (сыворотка крови и моча), изготовлена нами из пластмассовой пластинки толщиной 0,5 мм и шириной 6,5 см; длина (высота) ее не имеет практического значения.

На одном из концов пластинки вырезались прямоугольные зубцы высотой 6,5 мм, шириной 8 мм; расстояние между зубцами 2,8 мм. Таким образом,всего было шесть зубцов,что сразу позволило сделать в геле шесть насечек (щелей) и вносить в гель для проведения электрофореза такое же количество проб исследуемого материала. Гелевую пластинку обычно рекомендуется разрезать нихромовой проволокой диаметром 0,1 мм.

Гидролиз крахмала. Успешное разделение белковых фракций во многом зависит от качества крахмального геля, который должен обладать определенной степенью дисперсности, эластичности и прочности. Это имеет существенное значение не только в процессе проведения электрофореза, но и при дальнейших манипуляциях с гелем (окрашивание, отмывка, фотографирование, сушка и т.п.). Качество же крахмального геля во многом зависит от сорта крахмала, тщательности и особенностей проведения его гидролиза.

Процесс приготовления гидролизного крахмала — один из наиболее трудных и в то же время наиболее важных и ответственных моментов в методике получения крахмального геля. Описан ряд модификаций приготовления гидролизованного крахмала (Г.Ф.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966; Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; Е.Д.Васильева, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Однако общий принцип гидролиза такой, каким его описал О.Smithies (1955): крахмал гидролизуют соляной кислотой в среде ацетона при строго определенной температуре и в течение определенного промежутка времени для каждого сорта крахмала. Мы пользовались гидролизованным крахмалом, который получали из лаборатории линейных животных Белорусского научно-исследовательского института животноводства.

Гидролиз картофельного крахмала высшего сорта проводился в среде ацетона с добавлением соляной кислоты (из расчета на 300 г крахмала 600 мл ацетона и 9 мл соляной кислоты плотности 1,18) при температуре 38,6°С в течение двух часов.

Приготовление крахмального геля. Предварительно необходимо приготовить буферные растворы двух видов:

  • 1) для разведения гидролизованного крахмала (крахмальный буфер) и
  • 2) для заливки электродных кювет (электродный буфер).

Для электрофореза в крахмальном геле можно применять обычные буферные растворы с колебаниями pH от 2,0 до 11,0 (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Наибольшее распространение получили боратные растворы, предложенные О.Smithies, различные модификации которых были в дальнейшем использованы многими авторами (Н.Н.Старостин, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Дж.Уилкинсон, 1968 и др.). Весьма эффективны комбинированные буферные системы, например трисцитратный буфер (Г.В.Троицкий,1962; M-Poulak, 1957 и др.).

Нами использованы боратные буферные растворы следующего состава:

1) для разведения крахмала — 1,86 г борной кислоты (Н^ВО^) и 0,48 г гидроксида натрия (NaOH) на 1000 мл дистиллированной воды;

2) для заливки кювет — 18,6 г борной кислоты и 2,4 г NaOH на 1000 мл дистиллированной воды.

При подготовке крахмального геля обычно оптимальной считают концентрацию крахмала,равную 12—15% (В.Г.Троицкий, 1962; Е.М.Саминский, 1966) или 12-17 (В.Д.Успенскаяи соавт., 1968), 12-13% (Дж.Уилкинсон, 1968), 12—16 (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) и даже 18% (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969).

Следовательно, чтобы получить гель 12—18% концентрации,на 100 мл буферного раствора требуется 12—18 г гидролизованного крахмала. При этом описаны два варианта приготовления геля.

Читайте также:  Почему кровь в моче рези

Первый вариант — вся навеска крахмала растворяется в соответствующем количестве крахмального буфера, затем полученная суспензия, помещенная в круглодонную колбу с длинным горлом, нагревается на открытом пламени горелки при энергичном вращении до получения геля.

Однако в таком случае не всегда удается установить точно момент, когда следует прекратить нагревание, а от этого зависит качество получаемого геля и его пригодность для электрофореза. Чтобы избежать погрешностей, даются различные рекомендации (Е.М.Саминский, 1966; Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968 и др.).

Однако полностью устранить упомянутые дефекты не всегда удается. Учитывая это, предложен второй вариант приготовления геля, сущность которого заключается в следующем (Н.Н.Старостин,1966).

Приготовленную навеску крахмала помещают в отдельную колбу и добавляют туда примерно одну треть соответствующего количества буфёрного раствора; при взбалтывании получают суспензию крахмала. Остальные две трети буфера,находящегося в круглодонной колбе или другом сосуде достаточной емкости, нагревают до кипения, и затем при энергичном помешивании через воронку равномерной струей добавляют в него суспензию крахмала. В результате получается крахмальный гель заданной концентрации.

Нами использован второй вариант приготовления крахмального геля, только кипящий буфер вливали в суспензию крахмала, находящегося в колбе Бунзена, что снижало потерю крахмала, остающегося на стенках колбы, и затем переходили к деаэрации геля. Колбу Бунзена, закрытую притертой пробкой, подключали к водоструйному насосу. Отсасывание воздуха продолжали до тех пор, пока не прекращалось выделение пузырьков.

После этого колбу отсоединяли от водоструйного насоса и еще горячий гель медленно выливали в заранее подготовленную кювету, которая закрывалась крышкой таким образом,чтобы под ней не оставалось пузырьков воздуха, и поверх нее накладывали груз (обычно кирпич, обернутый в полиэтиленовую пленку). В таком виде крахмальный гель оставляли на два часа при комнатной температуре до образования плотной и эластичной гелевой пластинки.

Крахмальный гель готовили непосредственно перед электрофорезом. В проводимых опытах концентрация его составляла 15%. Охлаждать гель можно при комнатной температуре, как это делала, например, Е.Д.Васильева (1968), либо в холодной комнате в течение 2-2,5 часов, либо в рефрижераторе в течение 30—60 минут (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или нескольких часов (Е.М.Саминский, 1966).

Внесение в гель исследуемого материала. После того как гель остынет, необходимо аккуратно снять с кюветы крышку, тщательно очистить ее и борта кюветы от избытка геля (нами крышка промывалась водой и высушивалась) . С обоих концов гелевую пластинку осторожно отделяют скальпелем, от стенок кюветы,чтобы легче было подвести под нее мостики из фильтровальной бумаги.

Последние готовят из двух-трех слоев фильтровальной бумаги днирина которой соответствует ширине гелевой пластинки,а длина на 5—7 см превышает расстояние от кюветы до поверхности электродного буфера, в наших условиях она составляет 12—15 см.

Мостики из фильтровальной бумаги осторожно с помощью формовочной пластинки подводят на 1,5—2 см под гелевую пластинку с обоих ее концов.

Затем приступают к внесению в гель проб исследуемого материала. Насечки или щели в геле, в которые вносятся образцы исследуемой биологической жидкости, готовят заранее различными способами — скальпелем (Н.Н.Старостин, 1966), лезвием бритвы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) или пластмассовой гребенкой (В.Д.Успенская и соавт., 1968). Последний способ, на наш взгляд, наиболее удобен: он позволяет сделать сразу необходимое количество одинаковых по размеру и расположенных строго на одной линии щелей (линия старта).

Используя формовочную пластинку (гребенку), мы делали насечки в геле по линии, отстоящей на 2—3 см от края подведенной под гелевую пластинку полосы фильтровальной бумаги. В образованные таким образом отверстия с помощью пинцета и кусочков фильтровальной бумаги, размеры которых соответствовали размерам зубцов формовочной пластины, вносили пробы исследуемой сыворотки крови и концентрированной мочи.

Кусочки фильтровальной бумаги перед внесением в стартовую выемку предварительно смачивали сывороткой крови или мочой. Некоторые авторы (Ю.Н.Берг и соавт., 1967) рекомендуют вносить в гель образцы исследуемых биологических жидкостей с помощью пастеровской пипетки. Однако этот способ неточен, так как в различные щели может вноситься неодинаковое количество исследуемого материала.

В одну кювету было внесено сразу шесть проб: три—сыворотки крови и три—мочи.Причем сыворотку крови и мочу одного и того же больного помещали в рядом расположенные стартовые выемки, что представлялось удобным при идентификации белковых фракций мочи и сравнении их с аналогичными фракциями сыворотки крови.

По окончании внесения образцов в крахмальный гель кювету закрывали крышкой, предварительно смазав ее тонким слоем вазелинового масла (для предотвращения высыхания геля), и помещали в аппарат для электрофореза. Переходные мостики смачивали электродным буферным раствором и свободные концы их опускали в электродные кюветы, заполненные буферным раствором. Затем аппарат для электрофореза включали в сеть.

Условия для электрофореза. Большинство авторов электрофорез белков в крахмальном геле рекомендуют проводить при напряжении от 4-5 (Г.В.Троицкий, 1962; В.Д.Успенская и соавт., 1968) до 6—8 В/см (Ю.Н.Берг и соавт., 1967)и силе тока 2—2,5 тА на 1 см ширины кюветы или гелевой пластинки (Ю.Н.Берг и соавт., 1967; В.Д.Успенская и соавт., 1968).

Другие электрофорез проводили при общем напряжении до 200 В и более и силе тока 0,5—2 тА на 1 см ширины кюветы (Д.БДыкин, М.М.Щерба, 1969; В.А.Давыдова, Н.И.Макаревич, 1964; Дж.Уилкинсон, 1968). Длительность электрофореза при комнатной температуре составляет от 4—6 до 18—2U часов (Н.К.Лебедева и соавт., 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968) и даже до нескольких суток (Ю.Н.Берг и соавт., 1967 и др.).

Нами проведен электрофорез при силе тока 2,0—2,5 тА на 1 см ширины гелевой пластинки (14-16 тА) и напряжении 375—380В. Длительность электрофореза составляла 4 часа. При таких условиях проведения электрофореза, которые соблюдают большинство исследователей, было получено от 9 до 15 белковых фракций в сыворотке крови обследованных лиц.

Кроме того, при данных условиях можно в течение рабочего дня полностью закончить весь процесс подготовки и проведения исследования, в том числе и окрашивание электрофореграмм.

Окрашивание, проявление и фотографирование электрофореграмм. Окрашивание и проявление электрофореграмм в крахмальном геле выполнялось в соответствии с рекомендациями Ю.Н.Берг и соавт. (1967), В.Д.Успенской и соавт. (1968) и других. Поэтому отметим, что для приготовления раствора краски нами был использован растворитель, состоящий из метанола, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в соотношении 5:5:1.

В качестве красителя взят амидошварц 10В (Чехословакия) и кислотный сине-черный краситель, применяемый на ткацких фабриках. Последний лучше и более интенсивно окрашивает белковые фракции.

Раствор красителя готовили из расчета 10 г на 1000 мл растворителя. Окраска гелевых пластинок продолжалась 5-7 минут, после чего красящий раствор сливали, а гелевые пластинки 2-3 раза промывали в течение 5 — 10 минут растворителем. Затем кюветы с гелевыми пластинками заполняли этим же растворителем и, плотно закрыв стеклом, оставляли на ночь.

Утром, слив растворитель, электрофореграммы промывали от оставшихся излишков краски дистиллированной водой и оставляли их в ней на несколько часов. После окраски и отмывки белковые фракции четко вырисовывались на бледном фоне крахмального геля, особенно под тонким слоем чистой дистиллированной воды.

В таких условиях проводили фотографирование электрофореграмм аппаратом ’’Зенит-ЗМ” на пленку чувствительностью 130 единиц при искусственном освещении одной и той же интенсивности. Затем, отпечатав снимки на контрастной бумаге размером 9×12 см, получали фотоэлектрофореграммы (ФЭФГ).

Последние можно сохранять длительное время и использовать для количественного определения (при необходимости — многократно) величины отдельных белковых фракций методом денситометрии в отраженном свете. Кроме того, по ним можно проводить точную идентификацию каждой из белковых фракций сыворотки крови и мочи.

Для просветления фона гелевой пластинки и получения большей «выразительности» белковых фракций предложены различные методы дополнительной обработки гидролизованного крахмала, в частности ацетилированием (Е.Д.Васильева, 1968; В.Х.Панкина, 1971) и другими способами (Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968).

В наших исследованиях такие методы не применялись, так как гидролизованный крахмал получали уже в готовом виде, гель которого после окраски и отмывки давал сравнительно светлый тон.

Для сохранения крахмальные гелевые пластинки с электрофореграммами на них высушивали следующим образом: после фотографирования гелевую пластинку помещали на 12—24 часа в специальный раствор, состоящий из двух частей метанола и одной части глицерина.

Затем пластинку покрывали с обеих сторон фильтровальной бумагой и, расположив между стеклянными пластинками соответствующих размеров, вносили в термостат для сушки при температуре 50-60°С (сушку лучше проводить в потоке проходящего воздуха при температуре 40-50 С).

Обработанная и высушенная гелевая пластинка становится эластичной и прочной. В таком виде электрофореграм- ма в крахмальном геле может долго сохраняться, не теряя четкости контуров и интенсивности окраски полученных в ней белковых фракций. Этот способ более прост и удобен, чем некоторые другие (А.В.Азявчик, 1969 и др.).

Таким образом, в качестве документа можно хранить как гелевые пластинки (их заворачивают в целлофан, а затем в бумагу с необходимыми подписями на ней) ,так и снятые с них на фотопленку электрофореграммы. Кроме того, на бумаге можно делать схематические зарисовки полученных в геле протеинограмм сыворотки крови и мочи.

Количественный анализ электрофореграмм в крахмальном геле. Для количественного определения белковых фракций предложено несколько методов (элюирование с последующим фотокалориметрированием элюатов, фотометрирование в проходящем свете с последующей обработкой электрофореграмм гравиметрическим либо планиметрическим методом, денситометрия в проходящем свете и др.). Однако о выборе метода количественной оценки электрофореграмм существуют разные мнения.

Большинство исследователей считают метод денситометрии наиболее простым по технике выполнения, достаточно точным и поэтому наиболее перспективным (А.А.Соколов и соавт., 1956; А.Е.Гуревич, 1960; Е-А.Чуркин, 1965; Ат.Илков, Т.1 Николаев, 1959; Р.Даневев, Д.Стойнов, 1964 и др.), но отдельные авторы (О.А.Васильева, Г.Е.Барковская, 1960 и др.), признавая несомненную ценность денситометрии, отмечают, что метод элюирования дает меньше погрешностей.

При помощи прямого денситометрирования можно точно определить количественные соотношения отдельных фракций без их предварительного элюирования, которое часто трудно осуществить на практике из-за его сложности (Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964).

При этом количественный анализ электрофореграмм в агаровом геле чаще устанавливают методом прямой (или непосредственной) денситометрии в проходящем свете, так как пластинки агарового геля получаются достаточно прозрачными (В.А.Вайчювенас, 1963; A. Вилейшис и соавт., 1965; Р.А.Гуляева, В.А.Савран, 1967; Р.Протокалэ, B. Боеру, 1959 и др.).

Таким же образом считают возможным проводить количественное определение белковых фракций в полиакриламидном и крахмальном гелях (Г.В.Троицкий, 1962; Р.Цаневев, Д.Стойнов, 1964; Е.М.Саминский, 1966; Э.Г.Ларскийи соавт., 1967 и др.).

Однако гель крахмала по сравнению с агаровым и полиакриламидным менее прозрачен, что затрудняет деноитометрию, поэтому требуется предварительное просветление его, для чего, как уже указывалось, предложен ряд методов (Е. Д.Васильев а, 1968; В.Д.Успенская и соавт., 1968; Ю.Н.Берг, Е.А.Маркина, 1968; В.Х.Панкина, 1971 и др.).

Кроме того, гелевую пластинку необходимо предварительно высушить, что также требует дополнительного времени, навыка и реактивов. Все это существенно усложняет процесс количественной оценки электрофореграмм в крахмальном геле методом прямой денситометрии в проходящем свете, не удовлетворяет полностью исследователей и заставляет искать новые, более простые, доступные, но не менее точные пути количественного анализа белковых фракций.

Учитывая это, для количественной характеристики белковых фракций в крахмальном геле нами использован метод денситометрии с фотографий элекрофореграмм (ЭФГ), т.е. фотоэлектрофореграмм (ФЭФГ) в отраженному не проходящем свете (рис. 2).

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

Для сравнительной оценки точности применявшегося нами варианта денситометрии предварительно был проведен параллельный количественный анализ 19 электрофореграмм белков сыворотки крови, полученных методом электрофореза на бумаге, с помощью денситометра ERL10 (Карл Цейсс, Иена, DDR) путем прямой денситометрии, т.е. в отраженном свете непосредственно с элекрофореграмм и методом непрямой денситометрии также в отраженном свете, но с фотоэлектрофореграмм.

Средние показатели величины каждой из пяти белковых фракций, полученные двумя параллельно проводимыми методами денситометрии и подвергнутые статистическому анализу в целях установления достоверности их различий, представлены в табл.3.

Как видно из табл. 3, количественные показатели величины белковых фракций, полученных при денситометрии с ФЭФГ, статистически значимо не отличаются от аналогичных показателей, полученных путем прямой денситометрии с ЭФГ (Р> 0,3). Это свидетельствует о том, что метод денситометрии с ФЭФГ в отраженном свете не уступает по своей точности методу прямой денситометрии с ЭФГ.

Содержание белка в каждой фракции выражали в относительных (%) и абсолютных (г/л) величинах. Зная относительную величину белковой фракции и содержание общего белка сыворотки крови и мочи (г/л), расчет искомой фракции проводили по следующей формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

где у — величина искомой фракции, г/л; М — содержание общего белка, г/л; х — величина искомой фракции, %.

Как уже отмечалось, с помощью электрофореза в крахмальном геле в сыворотке крови здорового человека можно выделить до 12—20 и более белковых фракций.

Терминология этих фракций окончательно еще не установлена, но большинство исследователей (Ю.Н.Берг и соавт. 1967; И.И.Иванов, И.А.Пелишенко, 1969; Дж.Уилкинсон, 1968; О.Smithies, 1955, 1959; J.Traeger и соавт., 1965, 1966) пользуются следующими их обозначениями: на электрофореграмме белков в крахмальном геле обычно выявляются две фракции преальбуминов (Pr j, Р), за которыми следует широкая гомогенная фракция альбуминов (А) , затем две-три фракции постальбуминов, за ними фракция с-быстрых глобулинов, обозначаемая чаще р-глобулинов, следующие три (иногда и больше) фракции являются гаптоглобинами (Нр) или обозначаются как ф-фракции; далее расположена фракция медленно движущихся а1-макроглобулинов и фракция b-липопротеинов и, наконец, по другую сторону стартовой линии расположена фракция b-глобулинов.

Схема расположения упомянутых фракций и их количество представлены на рис. 3.

Статистический анализ. Полученные результаты исследования подвергаются статистическому анализу в целях определения достоверности различий сравниваемых абсолютных и относительных величин (Л.С.Каминский, 1964; П.Ф.Рокицкий, 1967; Б.С.Бессмертный, 1967; Д.Сепетлиев, 1968).

Критерий t для абсолютных показателей находим по формуле

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

а для относительных — по формуле:

Белковый состав мочи при важнейших заболеваниях почек

источник