Приготовление препаратов для микроскопии мочи

Для проведения данных исследований рабочее место должно быть оснащено следующими элементами:

1. Пипетки цилиндрической формы.
2. Центрифужные пробирки.
3. Пипетки с оттянутым концом.
4. Предметные и покровные стекла.
5. Чашки Петри.
6. Шпатель и зубоврачебная игла
7. Электрическая или ручная центрифуга.
8. Тетраборпокислый натрий гидрат.
9. Борная кислота.
10. Концентрированная соляная кислота.

Для приготовления нативных препаратов из осадков мочи необходимо выполнять следующие указания:

1. Производить собирание осадков мочи не раньше, чем через 1-2 часа после доставки ее в лабораторию и центрифугировать ее не менее 5-10 минут.

2. Оценивать видимые осадки в центрифужных пробирках по их цвету и характеру.

3. Приготовлять нативные препараты с помощью пипеток с оттянутым концом. Перед приготовлением препаратов центрифужную пробирку с мочой (после центрифугирования) быстрым движением наклоняют, сливают в пустую банку приблизительно третью часть мочи, находящейся над осадком, и тотчас же возвращают в вертикальное положение. Эту манипуляцию производят так, чтобы не взболтать осадок. Указательным пальцем правой руки закрывают верхнее отверстие пипетки с суженным концом. Вносят пипетку на дно центрифужной пробирки. Приоткрывают верхнее отверстие пипетки: осадок мочи с небольшим количеством жидкости набирается в пипетку. Моментально закрывают пальцем верхнее отверстие пипетки и извлекают ее из пробирки. Взятый осадок помещают на чистое предметное стекло и осторожно накрывают покровным стеклом. В правильно приготовленном препарате не должно быть пузырьков воздуха и избыток жидкости не должен выходить за пределы покровного стекла. Если осадок состоит из нескольких слоев, то вначале готовят препарат, как описано выше, а затем содержимое вновь центрифугируют и готовят препараты из каждого слоя в отдельности.

При отсутствии видимого на глаз осадка препарат готовят так же, как обычно.

При наличии значительного осадка из уратов, фосфатов или эритроцитов сначала готовят нативный препарат, а затем растворяют осадок, оставшийся в пробирке, и снова готовят препарат для микроскопического исследования. Приготовление двух препаратов необходимо потому, что значительный осадок из перечисленных выше компонентов препятствует обнаружению других элементов мочи.

Для pacтворения уратов рекомендуют использовать реактив Селена: 5 г буры и 5 г борной кислоты растворяют в 100 мл горячей дистиллированной воды. К оставшемуся после приготовления препарата осадку приливают реактив Селена в количестве, равном количеству мочи. Содержимое пробирки смешивают. При этом ураты растворяются. Ураты можно также растворить, добавив равное количество теплой водопроводной воды и подогреванием осадка мочи в приготовленном препарате. Недостаток последних двух способов состоит в том, что при охлаждении ураты вновь выпадают в осадок.

Фосфаты растворяют в 10% растворе соляной кислоты (10 г концентрированной соляной кислоты помещают в цилиндр и доливают до 100 мл дистиллированной водой). Техника растворения та же, что и уратов. При растворении фосфатов разрушаются форменные элементы осадка, поэтому необходимо один препарат приготовить до обработки 10% раствором соляной кислоты, а другой — после такой обработки.

Осадок из эритроцитов растворяют с помощью дистиллированной воды таким же способом, как и солевые осадки. После растворения эритроцитов вновь производят центрифугирование, а затем готовят нативные препараты по описанной выше методике.

В некоторых случаях (рак мочевыводящих путей) нативные препараты готовят из клочков, сгустков и нитей, пользуясь способом послойного исследования мочи по Эрлиху .

Этот способ состоит в следующем. Вслед за проведением физико-химического исследования и приготовлением нативных препаратов мочу, оставшуюся в посуде, взбалтывают и просматривают с целью обнаружения в ней клочков, сгустков и нитей. При наличии таких элементов всю порцию мочи, каждый раз взбалтывая, разливают в несколько чашек Петри. Затем, располагая чашки на белом и черном фоне, с помощью шпателя и иглы вылавливают имеющиеся клочки, сгустки или нити и помещают на предметное стекло, их растягивают, а затем добавляют каплю мочи. Приготовленный препарат покрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом.

Если приготовленные нативные препараты необходимо сохранить на некоторое время, их переносят во влажную камеру (эксикатор, чашки Петри и пр.), где, помимо препаратов, помещают увлажненную вату. Во влажной камере препараты сохраняются в течение нескольких часов.

источник

Микроскопическое исследование осадка мочи является неотъемлемой частью общеклинического исследования и часто служит основным методом диагностики заболеваний почек и мочевыводящих путей.

Микроскопию осадка мочи проводят с помощью обычного ориентировочного и количественных методов. Наряду с ними существуют некоторые специальные методы исследования.

Ориентировочный метод является более распространенным (используется при общеклиническом анализе мочи), но менее точным и дает лишь приблизительное представление о содержании элементов в осадке. Полученные результаты зависят от количества мочи, взятой для центрифугирования, количества оборотов центрифуги, правильного приготовления препаратов.

Микроскопическое исследование должно проводиться не позднее, чем через 2 часа после сбора мочи; при низкой относительной плотности (меньше 1010) рекомендуется производить микроскопию непосредственно после ее сбора, так как при стоянии лейкоциты и гиалиновые цилиндры быстро растворяются.

Исследование начинают со снятия осадка при помощи пипеток или стеклянных трубок диаметром 5 — 6 мм с оплавленными краями. На пипетку надевают баллон и осторожно погружают ее на дно склянки. Передвигая пипетку по дну склянки, набирают жидкость с осадком в пипетку, не допуская попадания ее в баллон. Из пипетки мочу (10 – 15 мл) переносят в центрифужную пробирку. Перед каждым сбором осадка мочи пипетку следует промывать дистиллированной водой, чтобы не занести элементы осадка одного анализа в другой. Пробирки с мочой центрифугируют 5 – 7 мин при 1500 – 2000 об/мин. После центрифугирования пробирку быстро опрокидывают для удаления надосадочной жидкости, затем переводят в исходное положение так, чтобы осадок остался на дне.

Осадок размешивают пипеткой (лучше пастеровской с тонким концом и маленьким резиновым баллоном). Небольшую каплю осадка помещают на предметное стекло и покрывают покровным, не допуская попадания пузырьков воздуха. При соблюдении этих правил препарат всегда имеет более или менее одинаковые размеры (площадь и высоту). Приготовленный препарат является нативным (неокрашенным).

Не рекомендуется: 1) проводить микроскопию препаратов без покровных стекол, так как при этом портится оптическая система микроскопа (при переводе на большое увеличение объектив нередко смачивается мочой); 2) готовить препараты из всего осадка (произвольный размер препарата не дает правильного представления о количестве форменных элементов).

Осадок мочи оценивают сначала под малым увеличением (окуляр 10х, объектив 8х), а затем переводят на большое увеличение (окуляр 10х, объектив 40х, при опущенном конденсоре).

Под малым увеличением делают общий обзор препарата. При этом обнаруживают и подсчитывают цилиндры, составляют общее представление о количестве солей, слизи и др.

Под большим увеличением детализируют отдельные элементы осадка, приблизительно подсчитывают количество лейкоцитов и эритроцитов в поле зрения, составляют окончательное суждение об осадке в целом. Для этого необходимо просмотреть не менее 10 – 15 полей зрения. Результат такого исследования заносят в бланк. Среднее цифровое выражение найденного количества элементов (например, эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров) дают приблизительно, указывая, сколько их в поле зрения при большом увеличении микроскопа. При малом количестве элементов осадка указывают их число в препарате. Для других элементов (эпителиальные клетки, кристаллы и др.) принято давать оценку: «большое», «небольшое» и «незначительное» количество.

Элементы мочевого осадка, видимые под микроскопом, разделяются на неорганизованные (различные соли, органические соединения и лекарственные вещества, осевшие в моче в виде кристаллов или аморфных тел) и организованные (цилиндры и все клеточные элементы – эритроциты, лейкоциты, эпителиальные клетки; среди организованных осадков могут также встречаться уретральные нити, сперматозоиды и элементы новообразований).

• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва «Медицина» 1975 г.
• Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
• Краевский В. А. Атлас микроскопии осадков мочи — Москва, «Медицина», 1976 г.
• Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике. Под ред. проф. М. А. Базарновой, проф. В. Т. Морозовой. Киев, «Вища школа», 1988 г.
• А. Я. Любина, Л. П. Ильичева и соавт. «Клинические лабораторные исследования», М., «Медицина», 1984 г.

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче. Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи. По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

Раздел: Анализ мочи

Метод Каковского-Аддиса является унифицированным методом количественного определения форменных элементов в суточном объеме мочи. Этот наиболее трудоемкий и имеющий много недостатков метод все реже применяется на практике в последнее время.

Раздел: Анализ мочи

Методы количественного определения форменных элементов в моче позволяют определить точное количество эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров, выделенных с мочой.

Раздел: Анализ мочи

Метод Амбурже относится к методам количественного определения форменных элементов в моче. При этом определяется количество форменных элементов, выделенных с мочой за 1 минуту.

Раздел: Анализ мочи

Неорганизованные осадки мочи состоят из различных солей, органических соединений и лекарственных веществ, осевших в моче в виде кристаллов или аморфных тел. Однако чаще неорганизованный осадок состоит преимущественно из солей.

Раздел: Анализ мочи

источник

Западно-Казахстанский Высший медицинский колледж. Сайт преподавателя МКЛИ Байбулатовой Светланы Андреевны

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОСАДКА МОЧИ

Микроскопическое исследование осадка мочи проводят ориентировочным методом при общем анализе и количественным подсчётом форменных элементов для более точной оценки степени лейкоцитурии и гематурии.

Ориентировочная микроскопия осадка мочи

Принцип: микроскопическое исследование нативных препаратов мочевого осадка, полученного при центрифугировании мочи.

Если элементы организованного осадка встречаются в каждом поле зрения, когда же элементы встречаются в небольшом количестве — числом в препарате. В одном препарате около 20 полей зрения.

1. Утреннюю порцию мочи тщательно перемешивают и помещают в центрифужную пробирку 10 мл исследуемой мочи.

2. Мочу центрифугируют в течении 5-10 мин при 1500 об/мин (или 5 мин при 2000 об/мин).

3. Быстрым наклоном пробирки сливают надосадочную жидкость (верхний слой), а оставшийся осадок пастеровской пипеткой переносят на середину предметного стекла и покрывают покровным. Осадок переносится с минимальным количеством жидкости, чтобы капля не расплылась.

4. Изучение препарата начинают с общего обзора под малым увеличением (8х10). Просматривают весь препарат по периметру и по диагонали. При этом обнаруживают цилиндры, составляют общее представление о количестве солей, слизи и др. Более детальное изучение с количественной оценкой производят при большом увеличении (10х40). При этом детализируют отдельные элементы осадка, приблизительно подсчитывают количество лейкоцитов и эритроцитов в поле зрения, составляют окончательное суждение об осадке мочи в целом.

5. Если элементы организованного осадка встречаются в каждом поле зрения, когда же элементы встречаются в небольшом количестве — числом в препарате. В одном препарате около 20 полей зрения.

Элементы организованного осадка мочи

1. Клетки плоского эпителия -полигональной или округлой формы, больших размеров, бесцветные, с небольшим ядром, располагаются поодиночке или пластами. Попадает из влагалища или наружных половых органов.

2. Клетки переходного эпителия — различной формы (полигональные, овальные, «хвостатые»)и величины (цилиндрические, округлые), с довольно крупным ядром. Иногда дегенеративными изменениями в виде грубой зернистости и вакуолизации цитоплазмы. Переходный эпителий попадает из почечных лоханок, мочевого пузыря, из верхней части уретры.

3. Почечный эпителий — неправильной округлой формы, небольших размеров (в 1,5-2 раза больше лейкоцитов), слегка желтоватого цвета. Чаще располагается в виде групп или цепочек. Выстилают почечные канальцы.

Норма : клетки плоского и переходного эпителия встречаются от единичных в препарате до единичных в поле зрения.

Клиническое значение: плоский эпителий особого значения не имеет, т.к. выстилает половые органы. Переходный эпителий выстилает мочевыводящие пути. В большом количестве могут встречаться при острых воспалительных заболеваниях мочевого пузыря и лоханок, интоксикациях, а также при мочекаменной болезни и новообразованиях мочевыводящих путей. Клетки почечного эпителия можно встретить при микроскопии осадка при нефритах, интоксикациях, расстройствах кровообращения.

Сочетание почечного эпителия с цилиндрами говорит о тяжёлом поражении почек.

1. Гиалиновые цилиндры — имеют нежную структуру, прозрачные, округлой формы на концах. На своей поверхности могут иметь зернистость за счёт аморфных солей или клеточного детрита. Образуется из белка, свернувшегося внутри канальцев, что свидетельствует о протеинурии, вследствие повышенной проницаемости клубочковых капилляров.

2. Зернистые цилиндры — имеют более резкие контуры и состоят из плотной зернистостой массы желтоватого цвета.

3. Восковидные цилиндры — имеют резко очерченные контуры и гомогенную с восковидным блеском желтовато-серую структуру. Образуются из уплотнённых гиалиновых цилиндров при задержке их в канальцах.

4. Эпителиальные цилиндры — состоят из клеток почечного эпителия.

В нормальной моче можно встретить единичные гиалиновые цилиндры (1-2 в препарате).

Клиническое значение: цилиндрурия является симптомом поражения паренхимы почек. Восковидные и гиалиновые цилиндры подтверждают реальность почечной протеинурии. Лейкоцитарные и эритроцитарные цилиндры дают возможность предположить источник лейкоцитурии (6-20 в поле/ зрения) и гематурии.

Элементы неорганизованного осадка мочи

• Кислые (мочевая кислота, ураты, оксалат кальция)
• Щелочные (кислый мочекислый аммоний, трипельфосфаты, аморфные фосфаты)

• Дрожжевые, плесневые. Чаще дрожжевые грибы рода Кандида, которые надо дифференцировать от эритроцитов и овальных оксалатов.

• Часто подвижные, палочки и кокки

• В виде прозрачных нитей, тяжей и цилиндров

источник

Приготовление нативного препарата мочи для микроскопического исследования. Ориентировочный метод исследования осадка.

Работа № 22 Микроскопия организованного осадка ( ориентировочный метод)

Микроскопическое исследование осадка мочи является неотъемлемой и важнейшей частью общеклинического исследования. Данное исследование часто служит основа­нием для диагностики заболеваний почек и мочевыводя-щих путей.

Мочевой осадок бывает двух видов: организованный и неорганизованный.

Микроскопия нативного препарата.

Микроскопическое исследование нативных препаратов мочевого осадка, полученного при центрифугировании мочи.

1. Центрифуга. 2. Мик­роскоп. 3. Центрифужные пробирки. 4. Предмет­ные и покровные стекла.

Ход исследования. Приготовление препаратов: в центрифужную пробирку поме­щают 10 мл из утренней порции мочи после тщательного ее перемешивания. Центрифуги­руют 5 мин при 2000 об/мин. Затем быстрым наклоном пробирки сливают прозрачный верх­ний слой, а оставшийся осадок переносят пипеткой с тонко оттянутым концом на середину предметного стекла и покрывают покровным. На­до стараться перенести осадок с минимальным количеством жидкости, чтобы покровное стекло покрывало его полностью. Большая капля рас­плывается, колеблется, препарат становится многослойным и это затрудняет микроскопиче­ские исследования. Изучение препарата начина­ют с малого увеличения (8X10) для общего обзора, а более детальное изучение препарата с количественной оценкой структур производят при большом увеличении (10X40). Если струк­туры встречаются в каждом поле зрения, то количественную оценку выражают их чис­лом, в поле зрения, при небольшом количестве структур, когда их встречают далеко не в каж­дом поле зрения,— числом в препарате.

Различают организованный и неорганизо­ванный осадок.

Эритроци­ты имеют дискообразную форму, окрашены в характерный желто-зеленый цвет. Включения в цитоплазме отсутствуют. В концентрированной моче кислой реакции эритроциты могут приобре­тать звездчатую форму. При длительном пре­бывании эритроцитов в моче низкой относитель­ной плотности они теряют гемоглобин и имеют вид одноконтурных илили двухконтурных колец. Деление эритроцитов на измененные и неизме­ненные не имеет первостепенного значения для решения вопроса об источнике гематурии.

Дифференцировать эритроциты надо от дрожжевых грибов и кристаллов оксалатов округлой формы. Грибы в отличие от эритроци­тов чаще овальной формы, более резко прелом­ляют свет, имеют голубоватый оттенок и почку­ются. Оксалаты обычно имеют различную вели­чину и резко преломляют свет. Прибавление к препарату осадка капли 5 % уксусной кислоты, приводит к гемолизу эритроцитов, оставляя грибы и оксалаты без изменения.

Нормальная величина. В норме эритроциты либо не встречаются, либо обнару­живаются единичные в препарате.

Клиническое значение. Гематурия может быть при пора.жении паренхимы почки (гломерулонефрит, пиелонефрит, опухоли и др.), при

тяжелой физической нагрузке и при пора­жениях мочевыводящих путей (почечных лоха­нок, мочеточников, мочевого пузыря, уретры).

Лейкоциты в моче имеют вид небольших зер­нистых клеток округлой формы. При низкой относительной плотности мочи размер их увели­чивается и в некоторых из них («активных») можно наблюдать броуновское движение гранул. При бактериуриях в щелочной моче лейкоциты довольно быстро разрушаются.

Нормальные величины. В норме в мочевом осадке у мужчин от 0 до 3 лейкоцитов в поле зрения, у женщин — от 0 до 5 лейкоцитов в поле зрения. ■

Клиническое значение. Увеличе­ние числа лейкоцитов в мочевом осадке свиде­тельствует о воспалительных процессах в почках или мочевыводящих путях. Наличие в моче «ак­тивных» лейкоцитов свидетельствует об’интен­сивности воспалительного процесса независимо от его локализации.

Эпителиальные клетки. Эпителиальные клет­ки в мочевом осадке имеют различное происхож­дение, т. е. десквамация их происходит с орга­нов, покрытых различными видами эпителия (многослойного плоского, переходного и куби­ческого призматического).

Клетки плоского эпителия полигональной или округлой формы, больших размеров, бес­цветные, с небольшим ядром, располагаются в виде отдельных экземпляров или пластами.

Клетки переходного эпителия различной формы (полигональные, «хвостатые», цилиндри­ческие, округлые) и величины, имеют желтова­тую окраску, интенсивность которой зависит от концентрации мочи и наличия пигментов, содер­жат довольно крупное ядро. Среди клеток можно встретить двуядерные. Иногда в клетках наблю­дают дегенеративные изменения в виде грубой зернистости и вакуолизации цитоплазмы.

Клетки почечного эпителия неправильной круглой формы, угловатые или четырехуголь­ные, небольшой вакуолизации цитоплазмы.

Клетки почечного эпителия неправильной круглой формы, угловатые или четырехуголь­ные, небольших размеров (в 1 1 /₂—2 раза боль­ше лейкоцита), слегка желтоватого цвета. В цитоплазме клеток обычно выражены дегенера­тивные изменения: зернистость, вакуолизация, жировая инфильтрация. В результате этих изменений ядра часто не выявляются. Клетки почечного эпителия относятся к кубическому и призматическому эпителию, выстилающему по­чечные канальцы. Чаще они располагаются в виде групп, цепочек. В некоторых случаях встре­чаются в виде комплексов округлой или фестон­чатой формы, состоящих из большого количест­ва клеток разной величины с явлениями жирово­го перерождения.

Нормальные величины. В мочевом осадке практически всегда встречают клетки плоского и переходного эпителия от единичных в препарате до единичных в поле зрения. Единич­ные в препарате клетки почечного эпителия на фоне нормальной микроскопической картины мочевого осадка не дают основания говорить о патологии.

Клиническое значение. Особого диагностического значения клетки плоского эпителия, попадающие в мочу из влагалища, наружных половых органов и мочеиспускатель­ного канала, не имеют, но если их обнаруживают расположенными пластами в моче, взятой кате­тером, то это может указывать на метаплазию слизистой оболочки мочевого пузыря. Такую картину можно наблюдать при лейкоплакии мочевого пузыря и мочеточников, что рассматри­вают как предопухолевое состояние.

Цилиндры — это белковые или клеточные слепки канальцев почек цилиндрической формы, различной ширины и длины. Образуются они в канальцах из свернувшегося белка, принимая их форму. Белко­вую основу цилиндров составляет уропротеин Тамма—Хорсфолла, об­разуемый эпителием почечных канальцев, и агрегированные сыворо­точные белки. Цилиндры встречаются почти всегда в моче с белком и почечным эпителием. В моче здорового человека за сутки могут быть обнаружены единичные цилиндры в поле зрения микроскопа. Появ­ление большого количества цилиндров в осадке мочи называют ци-линдрурией. Обнаружение цилиндров в осадке мочи имеет важное ди­агностическое значение, так как является признаком поражения почек (гломерулонефриты, нефротический синдром, инфекционные болез­ни, интоксикации). Гиалиновые цилиндры — белковые слепки каналь­цев — почти прозрачные с нежными контурами, один конец их закруг­лен, различной ширины и длины. Гиалиновые цилиндры обнаружива­ются и у здоровых людей после физической нагрузки. Они наблюда­ются в моче при всех заболеваниях почек. Зернистые цилиндры обра­зуются из перерожденных и распавшихся клеток почечного эпителия. Зернистая масса цилиндра состоит из белковых частиц. Зернистые ци­линдры имеют четкие контуры, обычно короткие и широкие, они бы­вают в моче при дистрофических процессах в канальцах почек при всех заболеваниях почек. Восковидные цилиндры имеют бледно-жел­тую окраску (как воск), резкие контуры с бухтообразными вдавлениями, гомогенную структуру, белок в них плотный. Восковидные цилин­дры встречаются в осадке мочи при хронических заболеваниях почек со значительной протеинурией (нефротический синдром). В осадке мочи могут встречаться и белковые цилиндры, имеющие на поверхно­сти массу эритроцитов (чаще выщелоченных), лейкоцитов и эпители­альных клеток почечных канальцев. Такие цилиндры называются эритроцитарными или кровяными (гломерулонефрит), лейкоцитарными (пиелонефрит) и эпителиальными (различные заболевания почек).

Бактерии. Бактериурия — это выделение микробов с мочой. При ис­пользовании ориентировочного метода исследования мочи выявление бактерий не имеет существенного диагностического значения. Более ин­формативен подсчет количества микробных тел в единице объема (сте­пень бактериурии) и посев мочи.

Нормативные величины: В нормальной моче можно встретить единичные гиалиновые цилиндры ( 1-2 в препарате).

Клиническое значение: Цилиндрурия является симптомом поражения паренхимы почки.

Задания для контроля

1.Какие элементы относят к организованному осадку мочи?

2. Каково клинико-диагностическое значение обнаружения большого количества лейкоцитов?

3. Каково клинико-диагностическое значение обнаружения большого количества

4.Какой эпителий можно обнаружить при микроскопировании нативного препарата мочи, их КДЗ?

5.Что такое цилиндры в моче , их разновидности и КДЗ?

источник

Препараты для микроскопирования готовят из крови, мочи, фекалий, колоний бактерий, тканей животных и растений и др. В некоторых случаях приготовление препаратов несложно, в других — требует специальной техники.

Наиболее просто готовят так называемые нативные препараты, т.е. объекты в естественном их виде. В этом случае материал наносят на предметное стекло и покрывают тонким покровным стеклом. Иногда его смешивают с изотоническим раствором хлорида натрия или глицерином для разжижения, осветления и предохранения от высыхания. Так готовят препараты дл микроскопического исследования осадка мочи, мокроты, фекалий.

Широко распространён метод окраски препаратов для микроскопирования. Способ окраски зависит от особенностей исследуемого материала и цели исследования.

Различные части препарата воспринимают краску по-разному, что делает их более чёткими, позволяет отличить друг от друга отдельные структуры. Например, мазки крови окрашиваются азур-эозином для подсчёта лейкоцитарной формулы, фуксином — для подсчёта тромбоцитов, азуром II -для подсчёта ретикулоцитов.

Для бактериоскопии — изучения под микроскопом микроорганизмов -существует большое количество методов окраски, в том числе и сложных -двумя и более красителями.

Существует негативный метод окраски, т.е. окрашивается фон препарата, на котором отчётливо видны неокрашенные микроорганизмы, например бледная трепонема.

Препарат для микроскопии не может быть толстым или плотным, так как свет должен хорошо проходить сквозь него, поэтому приготовление гистологических препаратов из тканей требует довольно сложной техники. Ткань обрабатывают спиртами, формалином или фиксирующими смесями, пропитывают целлоидином, парафином или желатином. Затем получают тончайшие срезы ткани при помощи специального прибора — микротома. После этого срезы окрашивают гематоксилин-эозином, Суданом, сложными смесями красителей, серебром и т.д. Срезы закрепляют на предметных стёклах смесью белка с глицерином. Для сохранения препаратов срезы заливают канадским бальзамом и покрывают покровным стеклом. Бальзам засыхает и гистологический препарат может храниться в течение многих лет.

Техника микроскопирования под средним и большим

Увеличением

Вращая верхнюю часть предметного столика, винтами устанавливают в центре поля зрения ту часть объекта, которую нужно рассматривать при большом увеличении. Затем, не поднимая тубуса, поворачивают револьвер так, чтобы поместить над объектом объектив № 40. Свет необходимо усилить: открыть диафрагму и приподнять конденсор до среднего положения. Снова находят рабочее расстояние между объективом № 40 и объектом. Для этого объектива оно равно примерно 2-3 мм.

Фокусировку производят очень осторожно, чтобы не допустить соприкосновения объектива с препаратом и повреждения того или другого, так как объектив почти касается препарата. Под контролем глаза медленно поднимают тубус до получения изображения объекта. Вращением микровинта добиваются чёткости изображения.

Иммерсионноемикроскопирование применяется при необходимости наибольшего увеличения. На препарат, а в некоторых случаях и на верхнюю линзу конденсора наносят каплю иммерсионного масла. Обычно для иммерсии применяют кедровое масло. Освещение должно быть сильным, т.е. конденсор поднят до отказа и диафрагма открыта. Иммерсионное масло применяют для создания между препаратом и объективом однородной среды,преломляющей световые лучи так же, как и линзы объектива. Это способствует получению чёткого изображения при большом увеличении.

Препарат помещают на предметный столик и прижимают к нему клеммами. Объектив № 90 погружают в каплю иммерсионного масла до соприкосновения с препаратом. Затем, глядя в окуляр, поднимают тубус очень осторожными движениями макровинта, так как рабочее расстояние между объективом и объектом в этом случае равно 1-1,5 мм. При помощи микровинта получают чёткое изображение и просматривают объект послойно.

При работе с микровинтом следует поворачивать его медленно на неполный оборот. Ни в коем случае не следует свободно и много вращать микровинт: это расстраивает Микромеханизм, что приводит к нарушению регулировки и уменьшению чёткости изображения.

Микроскопическое изучение объекта следует проводить поочерёдно то левым, то правым глазом. При этом оба глаза должны быть открыты, это предотвращает утомление. При работе необходимо удобно сидеть, не нагибаясь низко к окуляру. После каждого часа микроскопирования следует 10 мин отдыхать.

источник

Микроскопия является третьим (заключительным) этапом проведения общего анализа мочи. Полученные результаты можно увидеть на бланке ОАМ.

Хотя показателей осадка относительно немного, именно их отклонение от нормы чаще всего служит поводом для назначения специфичных проб урины.

Простейший в понимании пациента общий анализ мочи – это трудоемкая и непростая процедура. После оценки физических (плотность, pH, цвет, запах) и химических (белок, кетоновые тела, глюкоза, билирубин, уробилиноген) характеристик предоставленной урины приступают к получению мочевого осадка. Это происходит так:

1. Жидкость отстаивают в течение 1-2 часов.
2. Пипеткой берут со дна пробирки 10 мл мочи и помещают ее в центрифугу.
3. После 5-7 минутной обработки при 1500 об/мин жидкость сливают, а выпавший осадок помещают на предметное стекло микроскопа.

Иногда для более точного подсчета форменных элементов применяют метод Каковского-Аддиса, отличающийся от описанного некоторыми нюансами получения осадка.

• уточнения нарушений состава мочи, которые можно заподозрить исходя из других показателей (цвет, запах, плотность), и их количественной оценки;
• выявления наличия элементов, не очевидных при осмотре невооруженным взглядом или воздействии химических реактивов.

Результат микроскопии сам по себе не будет поводом для диагноза, но позволит обозначить направления дальнейшей диагностики воспаления или обменного нарушения в организме.

Обнаруженные осажденные структуры можно поделить на органические или организованные (эритроциты, лейкоциты, цилиндры, эпителий) и неорганические (соли в кислом или щелочном осадке, а также кристаллизовавшаяся «органика», бактерии, слизь, грибы). Нормальные показатели осадка можно свести в такую таблицу:

Также в зависимости от кислотности в урине могут встречаться кристаллы мочевины, креатинина или углекислой извести, однако диагностическое значение они имеют лишь в ряде особых случаев.

Отклонения показателей от нормы в большую сторону могут быть обусловлены физиологически (питание, физические нагрузки, беременность) либо указывать на патологию. Наличие в моче избытка эритроцитов возникает на фоне:

1. Ложной гематурии, связанной с употреблением блюд, содержащих цветные пигменты либо источников кровотечения в половых органах (менструации либо гинекологических заболеваний у женщин);
2. Почечной гематурии – вызванной повреждениями (некрозами) базальной мембраны почек, а точнее – гломерулонефритом либо туберкулезом почки. Эритроциты в этом случае буду вылощенными (деформированными) вследствие прохождения через мембрану; Гломерулонефриты – это группа патологий, имеющих первичную (наследственную), инфекционную, интоксикационную природу. Также они могут провоцироваться системными заболеваниями (васкулит) или онкологическими опухолями.
3. Попадание крови в мочу, уже прошедшую через почечный фильтр – при остром цистите, наличии камней в почках или мочевыводящих путях, доброкачественных (поликистоз) или злокачественных опухолях, травмировании мочевых путей конкрементами, нарушениях свертываемости крови. Возможно и физиологическое объяснение – передозировка антикоагулянтов (Гепарин, Варфарин).

Лейкоцитурия (до 60-100 форменных элементов в поле зрения или пиурия – лейкоциты сплошь, гной в моче) являются показателями:

• наличия очагов воспаления в почках или мочевыделительных путях (уретрит, цистите, пиелонефрит), гнойного процесса в околопочечной клетчатке (паранефрит);
• асептических воспалений, свойственных для хронических гломерулонефритов или амилоидоза почек;
• микоплазмоза, уреаплазмоза, хламидиоза (общий клинический анализ не в состоянии выявить возбудителей этих заболеваний).

Некоторое количество лейкоцитов может появиться в моче при нарушении правил сдачи анализа или воспалении наружных половых органов (вульвит, вагинит).

Цилиндры – это своеобразные слепки канальцев, образованные прошедшими через них форменными или аморфными образованиями. Они могут быть белковыми (гиалиновыми или восковидными), либо представлять собой деформированные клеточные структуры (эритроцитарные, эпителиальные или лейкоцитарные). Расшифровка отклонений от нормы следующая:

1. Некоторое количество гиалиновых цилиндров может быть следствием физической перегрузки или лихорадки. Значительное количество свидетельствует о патологиях, сопровождающихся массивной протеинурией.
2. Восковидные или зернистые структуры характерны для острого или хронического гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности, нефротического синдрома, либо атрофии эпителия канальцевой системы.
3. Эритроцитарные и лейкоцитарные структуры служат дополнительным подтверждением гематурии или пиурии почечного происхождения и соответствующих патологий.
4. Пигментные цилиндры сопровождают гемоглобинурию. Она характерна для заболеваний крови, анемий на фоне приема гемолитических ядов либо наследственной формы, переливаний несовместимого биоматериала.
5. Эпителиальные цилиндры указывают на тяжелые поражения клубочкового фильтра при отторжении имплантированного органа, отравлении тяжелыми металлами или передозировке препаратов – салицилатов.

Обнаруженные клетки эпителия классифицируются по типам и причинам их появления следующим образом:

1. Плоские, найденные в виде пластов – воспалительные процессы в мочевом пузыре или мочеиспускательном канале.
2. Переходные (цилиндрические) – выстилают почечные лоханки, мочевой пузырь, мочеточники, предстательную железу и простатический отдел уретры (у мужчин). Их наличие говорит о соответствующей локализации очага воспаления.
3. Почечные – являются признаком поражения канальцев – тубулоинтерстициального нефрита или гломерулонефрита.

Бактерии в моче – это всегда отклонение от нормы, однако трактовать его можно по-разному, а именно, как:

1. Ложную бактериурию – микроорганизмы содержатся в мочевых путях, но не могут размножаться ввиду высокого иммунитета или иных причин.
2. Бессимптомную – популяция чужеродной флоры велика, но симптомы отсутствуют.
3. Истинную – значительное количество бактерий и выраженные признаки воспаления (цистита, пиелонефрита, уретрита) различной природы (в том числе венерической или застойной).
4. Функциональную – имеющую место у беременных женщин, маленьких детей, либо лиц с низким иммунитетом (подростки, пожилые люди).

Дрожжевые грибки в урине – всегда отклонение, говорящее о развитии инфекции, вызванной условно-патогенными микроорганизмами рода Кандида. Среди внешних факторов размножения грибков – длительный прием антибиотиков, цитостатиков, кортикостероидов, внутренних – эндокринные нарушения.

Небольшое количество слизи выделяют оболочки мочевых путей. Множество слизистых нитей в осадке – дополнительный маркер воспалительного процесса в органах мочеполовой сферы.

Фибринные пленки, нити или сгустки, состоящие из нерастворимого специфичного белка, чаще всего указывают на острый цистит.

Соли, обнаруженные в урине, можно классифицировать на упорядоченные кристаллы или аморфные структуры. Состав солевого осадка зависит от pH мочи – существуют разновидности, которые никогда не обнаруживаются в кислой либо, наоборот, щелочной урине.

При нахождении в осадке диагностическое значение имеют:

1. Оксалат кальция (соли щавелевой кислоты – выпадают преимущественно в кислой среде) – кристаллы, появление которых может происходить на фоне избыточного поступления кислоты с пищей (отварные овощи, зелень, какао, гречка, миндаль, кешью) либо говорить о наличии обменных нарушений – сахарный диабет, подагра, аномалии кальциевого обмена или врожденной гиперкальциурии. Среди других распространенных причин – отравление техническими жидкостями (спиртом), низкая активность пищеварительных ферментов, дефицит магния или витамина В6 либо передозировка аскорбиновой кислоты.
2. Ураты (соли мочекислого калия, натрия, магния, кальция) – причиной их появления может быть длительный дисбаланс рациона (переизбыток белка) в сочетании в повышенной кислотностью мочи или обезвоживанием. Значительное количество уратов связывается с генетическими предпосылками, инфекциями мочеполовой системы, гепатитом, панкреатитом, тромбозом почек, гидронефрозом. Уратурия всегда сопровождает подагру и часто – мочекаменную болезнь.
3. Соли гиппуровой кислоты – кристаллы могут появиться на фоне употребления продуктов, имеющих в составе бензойную кислоту (брусника, клюква, фруктовые соки, алкогольные напитки, консервы, соусы). Также указывает на нарушения обмена веществ или печеночную недостаточность.

В щелочной моче обнаруживаются:

1. Аморфные фосфаты – предпосылками к появлению служат особенности рациона: избыток кальция в организме, злоупотребление продуктами, содержащими фосфор, преобладание в рационе растительных белков, переедание. Дополнительно могут указывать на воспаление мочевого пузыря.
2. Трипельфосфаты – кристаллические структуры. Причины появления – аналогично аморфным фосфатам.

Независимо от кислотности, мочевой осадок может содержать:

1. Кристаллы цистина – образуются на фоне нарушения белкового обмена либо нарушения механизма реабсорбции этой аминокислоты в канальцах почек.
2. Ксантин – обнаружение в моче характерно для лиц с наследственной предрасположенностью при наличии внешнего фактора – избытка пуринов в пище.
3. Лейцин и тирозин – появляются в осадке при отравлении фосфором, острой атрофии печени, некоторых инфекционных заболеваниях (скарлатина), болезнях крови (пернициозная анемия, лейкоз). Также бывает следствием обильной рвоты при беременности.
4. Холестерин – говорит о жировом поражении печени, цистите, эхинококкозе или хилурии (паразитарная инвазия, характеризующаяся «молочной» мочой).
5. Нейтральный жир и жирные кислоты – обнаруживаются на фоне избытка рыбьего жира в рационе либо вырождения эпителия канальцевой системы почек.

Результаты микроскопии позволяют выявить либо заподозрить наличие патологий даже при отсутствии клинических проявлений.

Даже это, самое тривиальное исследование, требует от пациента ответственного подхода к подготовке и сбору биоматериала. Получить достоверный результат поможет такой порядок действий:

1. В течение суток накануне сдачи отказаться от употребления красящих продуктов (морковь, свекла) и любых лекарств (особенно аспирина, антибиотиков, уросептиков). Исключение – вариант, когда анализ должен подтвердить концентрацию некоторого препарата. Прием алкоголя также недопустим.
2. Не допускать физических перегрузок и перегрева тела (баня, сауна).
3. За 12 часов до сдачи желательно воздерживаться от половой жизни.
4. Перенести анализ в случае «критических дней», лихорадки либо прохождения цистоскопии.
5. С утра, в день сбора, обеспечить адекватное гигиеническое состояние наружных половых органов – без применения агрессивного или антибактериального мыла (мочевой пузырь не опорожнять).
6. Собрать образец мочи. Для этого выпустить немного урины в унитаз, затем подставить стерильный контейнер, наполнить его примерно на 100 мл. Емкость не должна прикасаться к коже или слизистым.
7. Хранить биоматериал можно не более 2 часов при температуре 5-18 градусов. За это время контейнер нужно доставить в лабораторию.

Общий анализ мочи, включающий микроскопию – это сложное и информативное исследование. Он одинаково эффективен при профилактических осмотрах, наблюдении за ходом патологий или процессом терапии. Несколько простых подготовительных правил и аккуратность при сборе материала не позволят случайным факторам исказить результат.

источник

Доставленную в лабораторию мочу регистрируют в Журнале учета результатов клинического исследования мочи.

Лаборант проводит макроскопическое исследование мочи и определяет его физические свойства (количество, цвет, запах, прозрачность, рН и относительную плотность мочи).

Лаборант определяет наличие и количество растворенного белка и глюкозы; присутствие кетоновых тел, билирубина, уробилина, эритроцитов, лейкоцитов, продуктов жизнедеятельности бактерий – нитритов.

3. Приготовление нативного препарата осадка мочи для микроскопического исследовании:

– мочу в доставленном сосуде хорошо перемешивают, наливают в центрифужную пробирку и центрифугируют со скоростью 1500-2000 об/мин в течение 10-15 минут;

– надосадочную мочу сливают, а полученный осадок аккуратно перемешивают пипеткой с тонким вытянутым носиком;

– каплю размешанного осадка помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом (капля мочи должна соответствовать размеру покровного стекла), чтобы образовался монослой элементов осадка мочи.

1) проводить микроскопию препаратов без покровных стекол, так как при этом портится оптическая система микроскопа (при переводе на большое увеличение объектив нередко смачивается мочой);

2) готовить препараты из всего осадка (произвольный размер препарата не дает правильного представления о количестве форменных элементов).

4. Врач-лаборант проводит микроскопическое исследование осадка мочи:

– обзорное (ориентировочное) исследование при малом увеличении (окуляр х10, объектив 10,20,25 при опущенном конденсоре или при приподнятом конденсоре и максимально закрытой диафрагме); малое увеличение позволяет обнаружить редко встречающиеся элементы организованного и неорганизованного осадка, количество элементов и их распределение в препарате;

– детальное изучение элементов осадка при большом увеличении (окуляр х10, объектив 40), при этом опущенный конденсор поднимается или, при поднятом до предела конденсоре, приоткрывается диафрагма.

5. При необходимости готовят препараты мазков (осадка мочи, соскоба или пунктата) для окраски гематологическими красителями:

– если осадок мочи богат клеточными элементами, то из него сразу готовят мазок: каплю размешанного осадка наносят на обезжиренное предметное стекло и легким движением пластикового шпателя делают тонкий мазок не более чем на 2/3 длины предметного стекла, затем высушивают его на воздухе, фиксируют метило-вым спиртом, этиловым спиртом-ректификатом или фиксатором-краси-телем Май-Грюнвальда и докрашивают любым гематологическим красителем по Нохту или Романовскому с использованием для приготовления рабочего раствора краски буферную воду с рН 6,8-7,2. Мазки можно фиксировать и красить одновременно комбинированным фиксатором-краси-телем «Гемокрафикс» фирмы «Эко-лаб»;

– если в осадке мало клеточных элементов и в окрашенном мазке их практически не удается обнаружить, то используют метод обогащения: мочу разливают в несколько центрифужных пробирок и центрифугируют со скоростью 1500-2000 об/мин в течение 10-15 минут; сливают надосадочную мочу, а осадок из всех пробирок пипеткой собирают в одну пробирку; если в обогащенном осадке оказалось много мочи, ее дополнительтно центрифугируют и удаляют надосадоч-ную мочу (можно поставить пробирку вверх дном на фильтровальную бумагу). Из обогащенного осадка готовят окрашенный препарат по вышеописанной методике.

Если большое количество солей, в частности уратов, мешает микроско-пическому исследованию, то после центрифугирования сливают надосадочную жидкость и добавляют реактив Селена (5 г борной кислоты и 5 г буры, растворённых в 100 мл горячей дистиллированной воды) из расчёта на 1 мл осадка 9 мл реактива Селена. После повторного центрифугирования удаляют жидкость, осадок взбалтывают и наносят на предметное стекло.

Если из осадка не получается приготовить мазок (слизистый или жирный материал) к осадку необходимо добавить 1-2 капли нормально окрашенной сыворотки крови, аккуратно смешать их пипеткой и приготовить мазки.

Основная задача лаборатории состоит в том, чтобы сократить время исследования мочи до минимума. Наиболее оптимальным решением этой проблемы является методика скринингового анализа мочи с использованием тест-полосок Combur-test 10 фирмы «Roche Diagnostics». В основе метода лежит «принцип сита» – разделение образцов на те, которые требуют первооче-редного микроскопического исследования, и те, для которых микроскопия может не проводиться. Анализ образцов мочи проводится по следующим пара-метрам: pH, относительная плотность, белок, нитриты, лейкоциты, эритроциты. Любой положительный результат, полученный при анализе на тест-полосках, должен рассматриваться как критерий отбора для незамедлительного проведения микроскопического или какого либо специального (например, бактериологический посев) исследования и наоборот, отрицательный результат по всем шести перечисленным параметрам является высоко вероятным признаком отсутствия каких-либо патологических отклоне-ний в данной пробе. Использование такой методики позволяет увеличить выявляемость патологии с 80-85 % до 95%. Достигается это также и за счет того, что тест полоски, принцип действия которых основан на биохимических реакциях, помогают обнаружить лизированные нейтрофилы и эритроциты. Для стандартизации анализа, прово-димого на тест-полосках, применяется скрининговые анализаторы мочи.

Помимо стандартизации одно из основных задач приборов является уменьшение количества ошибок, допускаемых при визуальной оценке тест-полосок и реги-страции результатов. Высокопроизводительные анализаторы мочи (приборы серии «Мидитрон») значительно сокращают время на проведе-ние исследования, что имеет важное значение в исследовании мочи.

источник

Существует целый ряд заболеваний, клинический диагноз которых (малярия, возвратный тиф и др.) может быть подтвержден при помощи микроскопических исследований фиксированных и окрашенных тонких мазков из периферической крови или в препаратах «толстой капли» крови.

Кровь берут из пальца, предварительно протертого спиртом, уколов его стерильной иглой. Для приготовления тонкого мазка хорошо обезжиренное предметное стекло прикладывают к месту укола на пальце и получают небольшую каплю крови .

К переднему краю капли ставят шлифованное предметное стекло под углом 45 градусов. После того как кровь растечется по краю стекла, его продвигают вперед так, чтобы на предметном стекле получился равномерный тонкий мазок. Мазки крови вначале высушивают на воздухе, а затем фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова.

В том случае, когда концентрация микроорганизмов в крови невелика и их не удается обнаружить в тонких мазках, необходимо приготовить препарат «толстой капли». Для этого на предметное стекло наносят 2 – 3 капли крови, полученной при проколе мякоти пальца, и распределяют на стекле в виде пятно 10 – 15 мм. Препарат высушивают на воздухе и для разрушения эритроцитов (чтобы они не мешали обнаруживанию микробов) на мазок осторожно наносят 1 – 2 капли дистиллированной воды. Через несколько минут высушенный и зафиксированный препарат окрашивают, промывают струей воды, высушивают и изучают при помощи иммерсионного микроскопа.

При исследовании кроваво – слизистого или жидкого стула с целью выявления кишечных патогенных простейших начинать исследования необходимо со слизи. Отобранный кусочек слизи, наносят на предметное стекло. Для того, чтобы слой слизи был тонким, его необходимо расправить препаровальными иглами. После этого препарат накрывают покровным стеклом и исследуют микроскопически.

Таким же способом готовят мазок и из жидкого калового стула.

Мазок из оформленного или густого кашицеобразного стула готовится следующим образом: в капле физиологического раствора, предварительно нанесенной на предметное стекло, ополаскивают конец тонко заостренной деревянной палочки, предварительно погруженной в кал. Полученная взвесь накрывается покровным стеклом и производится просмотр при помощи микроскопа для первоначальной ориентировки. Точное определение паразитов осуществляется в фиксированных и окрашенных препаратах.

Исследование не окрашенных и окрашенных препаратов начинают с просмотра мазков при помощи малого увеличения. Малое увеличение дает возможность охватить большее поле зрения, и, следовательно, быстрее могут быть обнаружены паразиты. Детальное же изучение паразита проводится при помощи иммерсионного объектива.

Для исследования мокроты ее выливают в чашку Петри из емкости, в которой она находится. Бактериологической петлей выбирают гнойные комочки и размазывают их тонким слоем по поверхности предметного стекла.

При исследовании мочи ее собирают в сосуд. Дают ей отстояться на холоду или центрифугируют. Из полученного осадка готовят микропрепараты.

При микроскопическом исследовании спинномозговой жидкости микропрепараты готовят из фибринозного сгустка или из осадка, полученного при отстаивании или центрифугировании жидкости.

Препараты следует готовить с большой осторожностью. После того как препараты высохнут, их фиксируют и окрашивают.

Необходимость приготовления мазка – отпечатка из селезенки, печени, костного мозга, лимфоидной ткани возникает по разным причинам: определить первостепенность обсеменения того или иного органа в зависимости от пути и времени проникновения возбудителя в макроорганизм, активности ответной реакции иммунокомпетентных органов, вирулентных особенностей возбудителя (отношение к капсулообразованию) и пр.

Для приготовления мазка – отпечатка необходимо стерильно сделать горизонтальный срез органа и на свежий срез быстро и аккуратно без приложения усилий накладывается стерильное обезжиренное предметное стекло. И также быстро поднимается вертикально вверх, без смещения в какую – либо сторону.

Препарат высушивается на воздухе, фиксируется в жидком фиксаторе, промывается осторожно проточной водой, высушивается, окрашивается и микроскопируется.

источник

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

Препараты живых микроорганизмов. Для определения формы микроорганизмов, их подвижности, физиологического состояния готовят препараты живых микроорганизмов и ведут прижизненное наблюдение.

Приготовление препарата для наблюдения в раздавленной капле. На чистое предметное стекло стерильной петлей помещают каплю исследуемой жидкости и накрывают покровным стеклом. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться ребром его к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются пузырьки воздуха. Если пузырьки воздуха единичные, то они не мешают микроскопированию и ими можно воспользоваться при отыскании мелких микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Если пузырьков воздуха много, то препарат следует переделать. Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала за края покровного стекла. Излишек жидкости, вышедшей из-под покровного стекла, удаляют полосками фильтровальной бумаги.

Если рассматривают культуру, выросшую на плотной питательной среде, то на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и в нее вводят иглой небольшое количество исследуемой культуры. Приготовленный препарат рассматривают под микроскопом.

Приготовление препарата для наблюдения в висячей капле. Для этого используют предметное стекло со специальным углублением, с луночкой. Висячей каплей удобнее пользоваться для наблюдения подвижности микроорганизмов, размножения, прорастания спор.

Препарат готовят так: в центр покровного стекла помещают небольшую каплю жидкости с микроорганизмами; покровное стекло с каплей культуры накрывают предметным стеклом с лункой, предварительно смазав ее края тонким слоем вазелина; предметное стекло осторожно прижимают к покровному и быстро перевертывают препарат.

Приготовление препаратов для изучения клеточных структур. хМикроорганизмы можно наблюдать в неокрашенном виде и с прижизненной окраской. Для этого используют малоконцентрированные растворы различных красок, которые не оказывают на микроорганизмы губительного действия, дифференцированно окрашивают содержимое клетки и способствуют более точному изучению формы клеточных структур.

Для прижизненной окраски дрожжей и бактерий применяют нейтральную красную, метиленовую синюю, нейтральную фиолетовую, зеленый янус, эозин и эритрозин в очень незначительных концентрациях — от 0,001 до 0,0001%. Окрашенный препарат готовят введением под покровное стекло небольшой капли раствора красителя или микроорганизмы вносят в каплю краски на предметном стекле, после чего каплю накрывают покровным стеклом. Метод подробно описан в руководствах [109, 140].

Препараты убитых микроорганизмов. Такими препаратами пользуются в тех случаях, когда необходимо рассмотреть детали строения клеток (ядро, включения, споры), произвести подсчет микроорганизмов и т. д. Для этого микроорганизмы фиксируют на предметном стекле и окрашивают. Приготовление препарата состоит из ряда операций.

Каплю с микроорганизмами петлей распределяют возможно •более тонким слоем на обезжиренном предметном стекле площадью около 4 см2. Можно приготовить мазок, пользуясь стеклом со шлифованным краем, которое для распределения капли передвигают вдоль предметного стекла. Затем препарат высушивают при комнатной температуре. Для ускорения высушивания препарат мазком вверх осторожно прогревают над пламенем горелки.

Следующая важная операция — фиксация, целью которой является убить микроорганизмы и закрепить их на стекле. Существует много способов фиксации. Простейшим из них является фиксация пламенем. Для этого препарат медленно 3—4 раза проводят над верхней частью пламени горелки таким образом, чтобы сильно нагреть нижнюю поверхность стекла, чем и достигается фиксация. Для фиксации микроорганизмов также широко применяют растворы различных химических веществ: этиловый спирт (96% об.) в течение 5—20 мин; смесь равных объемов этилового спирта и эфира — 5 мин; метиловый спирт — 5 мин; смесь формалина (5 мл) со спиртом (95 мл) — 2 мин и др.

На фиксированный препарат наносят раствор какого-либо красителя в зависимости от цели исследования.

Прямое флуорохромирование — это непосредственная окраска живых или фиксированных микроорганизмов флуоресцирующими красителями, такими, как берберин-сульфат, акридин оранжевый, аурофосфин, нейтральная красная, примулин и др. Они объединяются по двум признакам: по способности ярко люминесцировать в сине-фиолетовых или ультрафиолетовых лучах и по избирательному связыванию с определенными тканевыми или клеточными элементами.

При окраске для наблюдений за формой микроорганизмов применяют водно-спиртовые растворы метиленовой синей или метиленовой фиолетовой (насыщенный спиртовой раствор, разведенный в 5—10 раз водой). Окрашивание длится 3—5 мин, после чего краску сливают, препарат промывают легкой струей дистиллированной или водопроводной воды и высушивают.

На сухой мазок наносят каплю воды, накрывают стеклом и микроскопируют. Если для исследования пользуются иммерсионной системой, то кедровое масло наносят непосредственно на сухой мазок [131].

Окраска по Граму — это важный диагностический признак. Метод основан на том, что протоплазма одних видов микроорганизмов образует прочное, нерастворимое в спирте соединение йода с красителем, у других видов это соединение не образуется. Для окраски препарат фиксируют и обрабатывают карболовым раствором генцианового фиолетового, затем раствором Люголя. Последовательность окраски препарата описана в литературе [131].

Из микроорганизмов, развивающихся в сусле и в вине, красятся по Граму (грамположительные), имеют сине-фиолетовый цвет — дрожжи, молочнокислые бактерии (стрептококки и палочки); не красятся по Граму (грамотрицательные), имеют красный цвет — уксуснокислые бактерии.

Окраска клеточных включений. Каплю исследуемой жидкости смешивают на предметном стекле с каплей водного раствора красителя, накрывают покровным стеклом и через 5 мин мйкро-скопируют.

При прижизненной окраске во л ют и н чаще всего образует зерна в вакуолях. При окраске нейтральной красной и метиленовой синей (растворы 1 :5000) волютин в вакуолях клеток дрожжей выпадает в виде ярко окрашенных красных или синих шариков [25]. При окраске фиксированного препарата метиленовым синим волютиновые зерна приобретают фиолетовый или фиолетово-красный цвет, а цитоплазма клетки окрашивается в голубой. Хорошо окрашиваются также включения молочнокислых бактерий—палочек.

Для наблюдений живых микроорганизмов готовят 0,01%-ные и 0,001 %-ные водные растворы красок. Для этого 10 мг сухой краски растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Для окраски фиксированных препаратов готовят растворы в соотношении 1 :40 (1 мл насыщенного спиртового раствора краски смешивают с 40 мл воды).

Гликоген почти всегда содержится в клетках микроорга-» низмов в виде включений или в растворенном состоянии в цитоплазме. Характерной для него является окраска йодом в

красно-бурый цвет. Для обнаружения гликогена на фиксированных препаратах используют крепкий раствор йода (7 г йода + 20 г йодистого калия-+ 100 мл дистиллированной воды). Препарат рекомендуется предварительно обезжирить, можно при фиксировании в смеси спирта с эфиром 1 : 2.

Для прижизненного окрашивания микроорганизмов используют раствор Люголя (0,33 г йода кристаллического+ 0,66 г йодистого калия+100 мл воды дистиллированной). Сначала в 10 мл воды растворяют йодистый калий, затем — йод и доливают водой до 100 мл.

Жир в клетках микроорганизмов чаще всего встречается в виде липопротеидных телец. Для окраски жира используют раствор 0,1 г Судана (судан III) в 20 мл 95%-ного спирта или в концентрированной молочной кислоте. К капле густой суспензии микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю 40%-ного формалина и оставляют на 5 мин. К фиксированному таким образом препарату прибавляют каплю раствора метиленовой синей (1:40) и оставляют на 10 мин. Затем добавляют каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового раствора Судана и воды. Плазма окрашивается в синий цвет, капли жира в розовый, а вакуоли остаются бесцветными.

Сера может быть в клетках в виде полужидких маслянистых капель, сильно преломляющих свет. Чтобы убедиться, что клетки дрожжей содержат элементарную серу, их следует высушить, затем растворить капли серы в сероуглероде или безводном спирте, или в растворе гидроксида калия и соды (в последней при нагревании). Обработав препарат высокой температурой, затем в течение 1 мин концентрированной пикриновой кислотой, после промывания водой можно наблюдать кристаллизацию серы в виде одноклиномерных кристаллов, чаще расположенных вне клеток.

При наличии большой массы дрожжей ее высушивают, помещают в сероуглерод, а затем профильтровывают настой, дают ему испариться на часовом стекле. Полученный желтый маслянистый остаток при сжигании превращается в сернистый ангидрид, легко обнаруживаемый по характерному запаху.

источник