Количественное определение активности амилазы мочи

Альфа-амилаза (диастаза) – это фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов, мальтозы и глюкозы. Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные железы. Амилаза секретируется в кровь, главным образом, из этих органов.

Плазма крови человека содержит преимущественно амилазу двух типов: панкреатическую и слюнную, третий тип амилазы – крупная или макроамилаза. С мочой выделяется, в основном, панкреатическая амилаза, что является одной из причин, почему определение амилазы в моче более информативно, чем в крови для оценки функционального состояния поджелудочной железы. Считают, что 65% амилазной активности мочи обусловлено панкреатической амилазой, в то время, как 60% амилолитической активности сыворотки обеспечивается амилазой слюнных желез. При остром панкреатите панкреатическая амилаза увеличивается в сыворотке до 89%, а в моче до 92% без изменения показателей амилазы слюнных желез.

Активность амилазы в крови и моче подвергается значительным изменениям в течение дня, а также отмечены индивидуальные различия. Колебания активности амилазы вызывают необходимость ее исследования в суточной моче для оценки функции поджелудочной железы.

Существующие методы определения активности α-амилазы делятся на 2 группы:

1. Метод конечной точки – основан на определении остатка нерасщепленного крахмала по степени интенсивности его реакции с йодом (метод Каравея).

α-амилаза сыворотки крови – 16-30 г/ч*л

1. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

2. Условия проведения опыта имеют большое значение, в частности точное время инкубации 5 минут, поэтому не рекомендуется проводить одновременное исследование более 5 сывороток.

3. Определение активности α-амилазы в моче проводится аналогично определению в крови, однако при гиперамилазурии рекомендуется разводить мочу с последующим пересчетом.

4. На активность α-амилазы влияют лекарственные препараты – антибиотики, обезболивающие, а также алкоголь.

Повышение активности амилазы, главным образом, встречается при заболеваниях поджелудочной железы.

При остром панкреатите активности фермента в крови и моче увеличивается более чем в 10 раз. Гиперамилаземия наступает непосредственно после начала заболевания, достигает максимума к 12-24 часам, после чего активность фермента быстро снижается и приходит к норме на 2-6 день. Обычно, гипрамилазурия длится дольше, чем увеличение активности фермента в сыворотке, поэтому на 2-3 день после болевого приступа более информативно определять активность α-амилазы в моче.

При хроническом панкреатите, раке поджелудочной железы повышение активности фермента не столь значительное. Кроме того, может быть незначительное увеличение активности фермента при заболеваниях, сопровождающихся сходной клинической картиной с острым панкреатитом: остром аппендиците, перитоните, прободной язве желудка и т.д.

Следовательно, резко выраженная амилаземия позволяет отдифференцировать острый панкреатит от хронических заболеваний поджелудочной железы, а также от других острых заболеваний брюшной полости.

Почти всегда амилаземия сопровождается амилазурией. Но определение активности амилазы мочи является менее точным показателем диагностики, т.к. выход амилазы в мочу связан с функцией почек. Незначительное повышение амилазы в крови при снижении ее уровня в моче можно объяснить нарушением выделительной функции почек.

Снижение амилазной активности наблюдается при некрозе поджелудочной железы, заболеваниях печени (гепатиты, циррозы), обширных ожогах, сахарном диабете, кахексии и т.д.

195.133.146.119 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.

Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно

источник

Мотивация. Количественное определение активности амилазы мочи является примером энзимодиагностики.

Реактивы. 0,1% раствор крахмала; 0,1% раствор Люголя.

Принцип. Амилаза осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы.

В качестве критерия активности амилазы в работе используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время. Определение активности амилазы основано на нахождении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом гамму цветов от фиолетового до оранжевого. Показателем полного расщепления крахмала является желтое окрашивание.

Амилазная активность выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщеплять 1 мл неразведенной мочи при определенных условиях. В норме амилазная активность мочи равна 4 – 64 единицам. Резкое повышения амилазной активности мочи наблюдается при острых панкреатитах.

1. Приготовление различных разведений мочи. В 8 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл дистиллированной воды. После этого в первую пробирку вносят 1 мл исследуемой мочи, тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем содержимое второй пробирки тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. до восьмой пробирки, из которой после перемешивания 1 мл смеси выливают. Таким образом, разведение мочи в указанных восьми пробирках составляет:

где n – номер соответствующей пробирки.

2. Во все пробирки, начиная с восьмой, из бюретки наливают по 1 мл 0,1% раствора крахмала.

3. Все пробирки в штативе помещают в водяную баню (45 о С) на 15 минут.

4. После инкубации все пробирки охлаждают и в каждую из них добавляют по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают.

1. Расчет активности амилазы мочи.

Активность амилазы мочи является величиной, обратной разведению слюны:

где n – номер последней пробирки, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание).

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Мотивация. Количественное определение активности амилазы слюны является примером энзимодиагностики.

Реактивы. 0,1% раствор крахмала; 0,1 % раствор Люголя.

Принцип.Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, которая затем под влиянием содержащейся в слюне мальтазы, расщепляется на 2 молекулы глюкозы.

В качестве критерия активности амилазы в работе используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время. Определение активности амилазы основано на нахождении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом гамму цветов от фиолетового до оранжевого. Показателем полного расщепления крахмала является желтое окрашивание.

Амилазная активность слюны, или амилокластическая сила слюны, выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщеплять 1 мл неразведенной слюны при определенных условиях. В норме амилазная активность слюны равна 320-640 единицам.

1. Приготовление рабочего раствора слюны. К 1 мл слюны добавляют 9 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Разведение слюны составляет: 10 -1 = 1/10

2. Приготовление различных разведений слюны. В 10 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл дистиллированной воды. После этого в первую пробирку вносят 1 мл рабочего раствора слюны, тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем содержимое второй пробирки тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. до десятой пробирки, из которой после перемешивания 1 мл смеси выливают. Таким образом, разведение слюны в указанных десяти пробирках составляет:

где n – номер соответствующей пробирки.

3. Во все пробирки, начиная с десятой, из бюретки наливают по 1 мл 0,1% раствора крахмала.

4. Все пробирки в штативе помещают в водяную баню (45 о С) на 20 минут.

5. После инкубации все пробирки охлаждают и в каждую из них добавляют по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают.

6. Результаты работы заносят в таблицу.

2. Расчет активности амилазы слюны.

Активность амилазы слюны является величиной, обратной разведению слюны:

где n – номер последней пробирки, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание).

источник

Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

Клинико-диагностическое значение.

Определение активности амилазы мочи и сыворотки крови широко используется в клинической практике для диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует. В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

Определение концентрации глюкозы в слюне энзиматическим(А) и колориметрическим(Б) методом

окисление глюкозы до глюкуроновой кислоты с помощью фермента глюкозооксидазы и образовании в ходе реакции перекиси водорода.Перекись+субстрат+фер-т пероксидаза= окрашенный продукт.

С(оп.)= Е(оп.)/ Е(ст.) х С (ст.) С(ст.)=5, 55 ммоль/л Е(ст.)=0,156 ммоль/л

Гл +о-толуидин = синезелен.окр-е, интренсивность кот. Прямо пропроц. Конц-ии Гл и определяется в фотоколориметре.

Уменьшение конц-ии Гл-поражениея паренхимы печени, нар-е ферм.акт-ти при распаде гликогена, гипофункция щитовидной, надпочечников, гипофиза, передозировка инсулина у больных сах. Диабетом, нар-я всас-я углеводов, при потерях крови.

Эмульгирование жира

ПРИНЦИП МЕТОДА: Эмульгирование жира различными амфифильными веществами происходит благодаря их адсорбции на границе раздела двух фаз — гидрофобной и гидрофильной.

В эмульсиях может происходить два явления – коагуляция и коалесценция.

Коагуляция – объединение частиц дисперсной фазы в агрегаты вследствие сцепления (адгезия) частиц при их соударении.

Соударения происходят в результате броуновского движения, а также седиментации, перемещения частиц в электрическом поле.

Характерные признаки коагуляции: увеличение мутности, появление хлопьевидных образований – флоккул, расслоение исходно устойчивой к седиментации системы с выделением дисперсной фазы в виде коагулянта.

Коалесценция – слияние капель жидкости внутри другой жидкости. В результате коалесценции происходит уменьшение степени дисперсности эмульсий, пен, аэрозолей вплоть до их расслоения на две фазы (жидкость – жидкость или жидкость – газ). Коалесценция происходит в результате флуктуции порыва пленок подвижной среды, разделяющих жидкие и газообразные частицы, что является причиной широкого разброса в значениях времени пленок, характеризующего устойчивость частиц коалесценции.

В результате коагуляции происходит слипание жировых частиц. При размешивании соединившиеся частицы легко разъединяются дисперсионной средой с восстановлением эмульсии, поэтому коагуляция не вызывает разрушения эмульсий с выделением исходных фаз.

При коалесценции капелек, наступающей при разрушении адсорбционных слоев, эмульсии необратимо разрушаются.

Роль эмульгаторов при образовании эмульсий в основном сводится к следующему: они способствуют снижению межфазной энергии и предохраняют диспергированные капельки при их сближении от слияния.

Анализ желудочного сока

который в сыворотке крови обусловлен в основном количеством, качеством растворенного белка и температурой. Влияние других компонентам сыворотки крови на коэффициент преломления значительно меньше. Определение коэффициента преломления проводят с помощью рефрактометров.

РАСЧЕТ: Определив показатель преломления по таблице, вычисляют процент содержания белка в сыворотке крови, для перехода к единицам системы СИ (г/л), результат следует умножить на 10.

НОРМА: содержание общего белка в плазме (сыворотке) крови здорового человека составляет 6.5-8.5 % или 65-85 г/л.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Тест основан на реакции креатинина с пикратом натрия, как описано Яффе. Креатинин реагирует с

щелочным пикратом, формируя красный комплекс. Для измерения выбирается временной интервал с

отсутствием влияния других компонентов сыворотки. Изменение оптической плотности образующегося

комплекса пропорционально концентрации креатинина в пробе.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Креатинин является результатом разрушения креатина, компонента мышц, который может трансформироваться в АТФ, она является источником энергии для клеток. Продукция креатинина зависит

от объема мышечной массы, варьирует незначительно, и уровни обычно очень стабильны.

Креатинин выделяется почками. С развитием почечной недостаточности происходит накопление в

крови мочевины, креатинина и мочевой кислоты. Повышение уровня креатинина может означать почечную

недостаточность. Клинический диагноз не должен ставиться по результатам одного теста,

он должен базироваться на совокупности клинических и других лабораторных данных.

Повышение значений: Физическая нагрузка. Акромегалия, гигантизм.Сахарный диабет. Инфекции.Гипотиреоз. Мясная пища. Увеличенный сердечный выброс. Беременность.Ожоги.Отравление окисью углерода.Белковая диета. Повышенный метаболизм. Анемии.

Снижение значений: Гипертиреоз. Анемии. Паралич, мышечная дистрофия, заболевания с уменьшением мышечной массы (например, нейрогенная атрофия, полимиозит и т.п.). Воспалительные и метаболические заболевания с вовлечением мышц. Развернутая стадия заболеваний почек. Лейкоз.Вегетарианская пища. Креатинин снижается в моче, оттекающей от почки со стороны стеноза почечной артерии.

Количественное определение активности амилазы мочи по Вольгемуту

ПРИНЦИП МЕТОДА: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, ликвор, слюна, сыворотка крови) основано на определении минимальной активности (количества) фермента, катализирующего в стандартных условиях гидролиз добавленного крахмала. Амилазная активность мочи выражается количеством мл крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 45ºC за 15 минут.

Расчет: Предположим, что полный гидролиз крахмала произошел в первых 4-х пробирках. В четвертой пробирке (где разведение мочи 1:16), 1/16 мл мочи гидролизует 2 мл 0,1% крахмала, значит 1 мл неразведенной мочи расщепит 32 мл 0,1% крахмала. Следовательно, активность амилазы мочи равна 32 единицы. В норме активность амилазы мочи равна 16-64 единицы.

источник

В крови и моче

Активность альфа-амилазы крови и мочи в течение суток (а также от од­ного дня к другому) значительно меняется. Кроме того, отмечены сущест­венные индивидуальные различия этих показателей у обследуемых без пато­логии органов пищеварения. Учитывая колебания экскреции альфа-амилазы с мочой, рекомендуется исследовать активность фермента в моче, со­бранной за сутки.

Изменение активности альфа-амилазы в крови и моче происходит при бе­ременности. Гиперамилаземия. Активность альфа-амилазы значительно возрастает при заболеваниях поджелудочной железы. При остром панкреатите активность фермента в крови и моче увеличивается в 10—40 раз. Гиперамилаземия наступает при начале заболевания, достигает максимума через 12—24 ч после развития, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6-е сут.

Активность фермента может быть повышена при ряде заболеваний, имею­щих сходную клиническую картину с острым панкреатитом, а именно: остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки. У больных с перитонитом увеличение амилазной активности является следствием развития образующих амилазу бактерий. Обычно активность фермента при указанных патологических состояниях повышается в 3—5 раз.

К заболеваниям, вызывающим сравнительно незначительную гиперамилаземию непанкреатического происхождения (т.е. без непосредственного по­ражения самой поджелудочной железы), относят холецистит, холелитиаз, со­стояние, связанное с разрывом желчного пузыря, заболевания почек, почечную не­достаточность, метастазирование раковой опухоли в легкие, поражение слюн­ных желез с обтурацией их протоков (ясная клиническая картина паротита поз­воляет легко объяснить гиперамилаземию), простатит, черепно-мозговую трав­му, травматический шок, ожоги, пневмонии, диабетический кетоацидоз, преры­вание беременности, послеоперационный период.

Активность альфа-амилазы в сыворотке крови повышается также при пер­форации пищевода, язве желудка, гастрите, острой кишечной непроходимости, ишемии и инфаркте тонкой кишки, перитоните, разрыве трубы при внематоч­ной беременности, сальпингите, аневризме аорты.

Основными причинами гиперамилаземии являются: нарушение оттока се­кретов из желез (продуцентов альфа-амилазы), повышение проницаемости гистогематического барьера в железах, некрозы ткани, нарушение выделения фермента через почечный фильтр.

Гиперамилаземию вызывают некоторые другие гормоны и многие фармако­логические препараты, в основном средства, приводящие к сокращению сфинктера Одди: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, ан­тикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, а также алко­голь.

Несмотря на то, что гиперамилаземия почти постоянно сопровождаетсяги-перамилазурией, определение активности альфа-амилазы мочи не всегда может служить точным показателем диагностики, так как выход амилазы в мочу связан с функцией почек. К тому же почки выделяют из крови только 24% секретированной пищеварительными железами амилазы.

Исследование активности альфа-амилазы в суточной моче — более надеж­ный биохимический тест выявления заболевания поджелудочной железы, чем исследование, базирующееся на анализировании разовой ее порции. После того как активность альфа-амилазы крови после приступа панкреатита воз­вратится к норме, она может оставаться повышенной в моче до 7 сут.

Коэффици­ент «активность альфа-амилазы крови/активность альфа-амилазы мочи» слу­жит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.

Гипоамилаземчя в клинической практике встречается редко. Она отмечает­ся у больных с заболеваниями печени (гепатитами, циррозами), злокачествен­ными опухолями (особенно при наличии метастазов в печень), обширными ожогами, кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, общим расстройством пи­тания, падением массы тела, кахексией, а также под влиянием интоксикации (например, при токсикозе беременных). Снижение активности альфа-амила-зы чаще всего свидетельствует о недостаточности экзокринной функции под-желудочной железы. К уменьшению активности фермента приводит введение в организм цитратов и оксалатов.

Определение общей активности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (L-лактат; НАД-оксидоредуктаза,КФ 1.1.1.27) — гликолитический (цитозольный цинксодержащий) фермент (молекулярная масса 135 000 Д), обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Непременный участник данной реакции — окисленный никотинадениндинуклеотид, используемый в качестве кофактора фермента, играю­щего роль акцептора водорода.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

СНзСНОНСОО»+НАД+ Лактатдегидрогеназа СНзСОСОО’+НАД • Н+Н+

Фермент широко распространен в организме человека. По степени убыва­ния активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различ­ных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента. Изменения в строении белковой части изоферментов обусловлива­ют их различные физико-химические свойства (в частности, неодинаковую электрофоретическую подвижность в агаровом, крахмальном, полиакриламид-ном и других гелях).

В плазме (сыворотке) крови выявлено пять изоэнзимов лактат-дегидроге-назы – ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГз, ЛДГ4, ЛДГ5, — располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности.

Каждый из изоэнзимов представляет собой тетрамер, образованный субъ­единицами Н и М. Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ5 — из печени. ЛДГ в цитоплазме клеток и сыворотке крови представлена 5 изоферментами.

Субъединица М обнаруживается главным образом в тканях с анаэробным метаболизмом, в то время как субьединица Н присутствует в тканях с преобла­данием аэробных процессов. Методом электрофореза на носителях удается разделить все 5 изоферментов ЛДГ, которые в сыворотке крови здоровых людей представительству­ют в следующем процентном отношении: ЛДГ; (14—26%), ЛДГ^ (29—39%), ЛДГз (20-26%), ЛДГ4 (8-16%), ЛДГз (6-16%) — В.Н.Титов с соавт. (1988).

Лактатдегидрогеназа содержится не только в плазме, но и в значительном количестве в эритроцитах крови, поэтому сыворотка, используемая для анали­за, должна быть свежей, без следов гемолиза.

Методы определения общей активности ЛДГ подразделяются на две ос­новные группы: 1) кинетические, базирующиеся на оптическом тесте Варбур-га (оптическом эффекте, связанном с превращением НАД в НАД • Н, и на­оборот) и 2) методы, в которых определяется количество образовавшегося продукта или потребляемого субстрата после фиксированного инкубационно­го периода (методы конечной точки).

Работа №32 Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод определения активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови (по Севелу и Товареку)

Принцип метода. L-лактат в щелочной среде в присутствии ЛДГ сыворот­ки и добавленного НАД окисляется в пируват. По степени его образования и судят об активности фермента.

1. 0,45 моль/л раствора молочнокислого натрия. В мерную колбу емкостью 100 мл вносят 5 мл молочной кислоты концентрации 800 г/л ийи 10 мл молочной кислоты концентрации 400 г/л и нейтрализуют ее 2 н раствором едкого натра до слабощелочной реакции с рН 7,5 (при пользовании фенолфталеином должна развиться слабо-розовая окраска). Объо м дово­дят дистиллированной водой до метки.

2. 0,03 моль/л раствора пирофосфорнокислого натрия, рН 8,8. В мерную колбу емкостью 500 мл вносят 6,69 г Na₂ Р₂O₅ • Н₂О, 50 мл диет» ллиро-ванной воды, смесь тщательно перемешивают и устанавливают) рН раствора 8,8 с помощью 1 н раствора НС1. Объем содержимого колбы дово­дят до метки дистиллированной водой. Реактив стабилен в течение ме­сяца при хранении в холодильнике.

3. Раствор НАД. 3 мг НАД (х. ч.) растворяют в 1 мл дистиллированной во­ды (из расчета 0,6 мг на пробу). Реактив стабилен 4 нед при хранении в холодильнике.

4. Раствор 2,4-динитрофенилгидразина. 19,8 мг 2,4-динитрофенилгидра-зина растворяют в небольшом объеме 1 н раствора соляной кислоты при нагревании смеси на водяной бане. После охлаждения доводят объем 1 н раствором соляной кислоты до 100 мл. На следующий день ре­актив фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла, он годен к употреблению в течение года.

5. 0,4 н раствор едкого натра.

6. 1 н раствор соляной кислоты.

7. Стандартный раствор пировинограднокислого натрия. 11 мг кристалличес­кого пировинограднокислого натрия растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в мерную колбу емкостью 100 мл и доливают объем раствора до метки дистиллированной водой. 1 мл раствор содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг пировиноградной кислоты. Рабочий стандартный раствор готовят разведением основного в 10 раз дистиллированной водой. В 1 мл рабочего раствора 8,8 мкг пировиноградной кислоты.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД и прогревают 5 мин при 37° С. Затем добавляют 0,8 мл раствора пи фосфорнокислого нагрия и 0,2 мл раствора молочнокислого натрия, предварительно прогретых при 37°С. Смесь инкубируют при 37°С в течение 15 мин час же после инкубации в пробу доливают 0,5 мл раствора 2,4-динитpoфeнилгидразина и выдерживают ее 20 мин при комнатной температуре. Затем вносят 5мл раствора едкого натра, содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин

измеряют абсорбцию в области длин волн 500—560 нм, например на ФЭКе с зеле­ным светофильтром в кювете с толщиной слоя 10 мм. Регистрируют показатели оптической плотности исследуемой пробы, учитывая абсорбцию контрольной.

Контрольную пробу ставят так же, как опытную, но разведенную 1:2 сыво­ротку добавляют после инкубации смеси. Рассчитывают активность фермента по калибровочному графику. Активность лактатдегидрогеназы выражают в ммоль пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 л сыво­ротки в течение 1 ч при 37°С.

Чтобы получить данные для построения калибровочного графика, необхо­димо сделать следующее. Из рабочего стандартного раствора пировиноград­нокислого натрия приготовить ряд разведений (табл.2). Затем в пробирки прилить по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее стандартные пробы обработать так же, как опытные.

При постановке контрольной пробы в пробирку вносят 0,6 мл дистиллиро­ванной воды, 0,8 мл раствора пирофосфата и 0,5 мл раствора 2,4-динитрофе­нилгидразина. Далее пробу обрабатывают аналогично опытной.

Для нахождения показателей активности лактатдегидрогеназы в размерности «ммоль пировиноградной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации при 37°С» количество мкмоль пировиноградной кислоты в стандартной пробе умножают на коэффициент 120 или количество мкг пировиноградной кислоты — на 1,41.

Для выражения активности фермента в единицах новой размерности мож­но применять и другую формулу:

Активность лактатдегидрогеназы в ммоль/(ч • л) = С • 120: 88,

где С — количество мкг пировиноградной кислоты в пробе, 120 — коэффи­циент пересчета мкг пировиноградной кислоты в мг, 88 — фактор пересчета показателей из «мг» в ммоль.

При построении калибровочного графика на оси абсцисс откладывают значения активности фермента, выраженные в размерности, ммольДч • л) и представленные в последней графе таблице 33. Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 10 ммоль/(ч • л).

Данные к построению калибровочного графика

Нормальные величины активности общей ЛДГ в сыворотке крови — от 0 8 до

1. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.

2. Для исследования лучше использовать свежую сыворотку.

3. Щавелевоуксусную плазму употреблять не рекомендуется, так как соли щавелевой кислоты ингибируют фермент.

Пользуясь данным методом, можно исследовать имочевина-стабильную фракцию ЛДГ.

Принцип метода основывается на свойстве мочевины почти на 100% инги-бировать активность ЛДГз. При параллельном определении активности общей ЛДГ рассчитывают процент содержания стабильной к мочевине фракции.

Реактивы. Те же, что и в предыдущем методе. Дополнительно используют раствор мочевины, приготовленный на 0,03 моль/л раствора пирофосфорно-кислого натрия (14,4 г мочевины вносят в 100 мл раствора пирофосфорнокис-лого натрия, рН 8,8).

Ход определения активности общей и мочевиностабильной фракции ЛДГ отличается такими особенностями:

1. В методике исследования активности мочевиностабильной фракции ЛДГ применяется раствор пирофосфата натрия, содержащий мочевину

2. При выполнении первого этапа метода 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, тщательно смешивают с 0,08 мл раствора пирофосфорнокислого на­трия,содержащего мочевину, и с 0,3 мл раствора НАД. Преинкубацию проводят в течение 1 ч при + 25°С, закрыв пробирку крышкой. Затем в пробирку добавляют 0,2 мл раствора молочной кислоты и инкубиру смесь 15 мин при +37°С.

3.В методике определения общей активности ЛДГисключают этап пр варительного прогревания раствора при температуре 37°С и после сливания реактивов комнатной температуры сразу же приступают к инкубации смеси в течение 15 мин при температуре 37°С.

В остальном метод не отличается от описанного выше. Расчет сводите установлению процентного содержания мочевиностабильной ЛДГ по отношению к общей.

В нормемочевиностабильная ЛДГ состава 25-36% от общей ЛДГ.

источник

α‑Амилаза (диастаза, 1,4‑a‑D‑глюкангидролаза, КФ 3.2.1.1.) катализирует гидролиз α‑1,4‑глюкозидных связей крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и других полимеров. Молекулярная масса фермента около 48000 Д. В состав молекулы входит атом кальция, который не только активирует фермент, но и защищает его от действия протеиназ, активность амилазы возрастает при влиянии ионов хлора. В крови она представлена двумя изоферментами: панкреатическим — P‑тип и слюнным — S‑тип, каждый из которых делится на несколько фракций. Изофермент S‑типа составляет в целом 45‑70% (в среднем 57%), остальное приходится на долю P‑типа. Оба изофермента имеют почти идентичные каталитические и иммунологические свойства, незначительно отличаются по электрофоретической подвижности, но хорошо разделяются при гель‑фильтрации на ДЭАЭ‑сефадексе. Существует также макроамилаза, которая не выделяется почками, но может встречаться в сыворотке крови в норме (около 1 % здоровых людей) и патологии (2,5 %).

Высокая активность амилазы наблюдается в околоушной и поджелудочной железах. Вместе с тем, ее активность, хотя и намного ниже, обнаруживается в толстом и тонком кишечнике, скелетных мышцах, печени, почках, легких, фаллопиевых трубах, жировой ткани. В крови фермент связан как с белками плазмы крови, так и с форменными элементами. Активность фермента одинакова у мужчин и у женщин и не зависит от характера принимаемой пищи и времени суток.

Существующие методы изучения активности a‑амилазы в биологических жидкостях делятся на две большие группы:

1. Сахарифицирующие (редуктометрические), основанные на исследовании образующихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию глюкозы и мальтозы.

2. Амилокластические , базирующиеся на определении остатка нерасщепленного крахмала:

• по степени интенсивности его реакции с йодом. Эти методы более чувствительны и специфичны, но точность их во многом зависит от качества крахмала и оптимизации условий определения.
• по вязкости суспензии крахмала, не отличаются высокой точностью и сейчас не применяются.

3. Методы с применением хромогенных субстратов –– основаны на использовании комплексов субстрат‑краситель, которые под действием α‑амилазы распадаются с образованием водорастворимого красителя.

4. Методы, основанные на сопряженных ферментативных реакциях :

Крахмал + Н₂О Мальтоза + Мальтотриоза + Декстрин

Мальтоза + Н₂О 2 Глюкоза

Глюкоза + АТФ Глюкозо‑6‑Ф + АТФ

Глюкозо‑6‑Ф+НАДФ Глюконат‑6‑Ф + НАДФН

Активность фермента устанавливается по скорости накопления НАДФН.

В качестве унифицированных утверждены два амилокластических метода: Каравея (со стойким крахмальным субстратом) и Смита‑Роэ.

α‑Амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего, растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально каталитической активности фермента.

Повышение активности фермента происходит главным образом при заболеваниях поджелудочной железы. При остром панкреатите активность в крови и моче возрастает в 10‑30 раз. Гиперамилаземия наступает в начале заболевания, достигает максимума к 12‑24 ч, затем снижается и приходит к норме на 2‑6 день. Однако при тотальном панкреонекрозе может не отмечаться повышение активности амилазы. Возрастание активности фермента выявляется при беременности, почечной недостаточности, кишечной непроходимости, заболеваниях желчных путей, диабетическом кетоацидозе, некоторых опухолях легких и яичников, поражении слюнных желез. Выявление повышенного количества изоферментов P‑ или S‑типа не патогномонично для какого‑либо заболевания.

Низкие уровни фермента в сыворотке крови не имеют существенного значения.

источник

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА БИОХИМИИ

ПО БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО

И ИНОСТРАННОГО ФАКУЛЬТЕТОВ

Методические рекомендации подготовлены заведующим кафедрой биохимии ГГМУ профессором В. В. Лелевичем, профессором Н. К. Лукашиком, доцентами В. В. Воробьевым, В. В. Климовичем, А. А. Масловской, Л. Н. Дворянинович..

Под общей редакцией профессора В. В. Лелевича.

Заведующий кафедрой общей и биоорганической химии

Гродненского государственного медицинского университета

Утверждено и рекомендовано к печати решением Центрального научно-методического Совета университета (протокол № от ).

Преподавание биологической химии в медицинских вузах должно со-ответствовать динамическому развитию биохимической науки. В связи с этим периодически обновляются учебные программы и методические доку-менты. Действующая учебная программа по биологической химии для студентов лечебно-профилактического факультета была разработана и утверждена МЗ РБ в 1997 г. В течение трех последних лет она адаптирована в учебном процессе на лечебно-профилактическом и иностранном факультетах. На кафедре биохимии ГГМУ был разработан ряд методических материалов в соответствии с действующей учебной программой: рабочая программа, экзаменационные вопросы, экзаменационные билеты, тестовые задания для компьютерного контроля знаний. Для оптимизации учебного процесса студенту необходимы методические рекомендации, где указаны все темы практических занятий, лабораторные работы, выполняемые студентами, рекомендуемая учебная литература. Это позволит студентам создать цельное представление об учебной программе по предмету, унифицировать их подготовку к занятиям, избавить от переписывания вопросов к каждому занятию.

В предлагаемых методических рекомендациях приводятся темы 36 лабораторных занятий, что соответствует учебному плану, выполняемому в течение 3 и 4-го семестров.

При подготовке теоретического раздела занятия необходимо внимательно ознакомиться с контрольными вопросами для самоподготовки. Изучение теоретического материала должно начинаться с восстановления исходного уровня знаний к теме или разделу (из биологии, биоорганической химии или уже пройденных тем биохимии). Необходимая учебная информация содержится в рекомендуемых разделах учебников «Биологическая химия» Т. Т. Березова, Б. Ф. Коровкина (М., 1990 и 1998 г.); А. Я. Николаева (М., 1989); лекционном курсе.

При подготовке к лабораторной работе рекомендуется изучить кон-трольные вопросы по данному разделу, материал, изложенный в «Руковод-ствах к практическим занятиям по биологической химии» Т. Л. Алейни-ковой, Г. В. Рубцовой (М., 1988); О. Д. Кушмановой, Г. М. Ивченко (М., 1983); Н. К. Лукашика, В. В. Климовича (2000) и составить протокол к лабо-раторной работе. В протоколе должны быть отражены следующие разделы:

3. Название лабораторной работы.

4. Принцип метода и химический механизм реакций.

5. Схема выполнения (ход) работы.

Разделы 1-5 заполняются в протоколе при самоподготовке, разделы 6-7 в процессе выполнения лабораторной работы. Для показателей, определяемых количественно, в протоколе указать референтные величины и клинико-диагностическое значение.

Изучение отдельных разделов биохимии заканчивается проведением контрольных занятий, на которых обобщаются все знания, полученные по данной части учебной программы.

Надеемся, что подготовленные коллективом кафедры методические рекомендации помогут студентам успешно овладеть программными знаниями по биологической химии.

З А Н Я Т И Е № 1

ТЕМА: ВВЕДЕНИЕ В БИОХИМИЮ

ЦЕЛЬ: Сформировать у студентов представление о предмете и задачах биологической химии, специфике биохимических лабораторий и особенностях работы с биологическим материалом.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Правила работы в биохимических лабораториях. Техника безопасности.

2. Колориметрия, общий принцип. Устройство и особенности

3. Пипетки, предназначение, типы.

4.1. Отработка практических навыков использования пипеток.

4.2. Работа на фотоэлектроколориметре. Построение калибровочного

5. Контроль выполнения лабораторной работы.

6. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным

занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983. – С. 80.

2. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным

занятиям по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 4-8.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Предмет и задачи биологической химии.

2. Этапы истории биохимии, основные разделы и направления.

3. Живые системы, их характеристика.

4. Объекты биохимических исследований и методы биохимии.

5. Медицинская биохимия, теоретические и практические аспекты.

6. Место биохимии среди биологических дисциплин и ее роль в формировании мировоззрения.

7. Вклад ученых-биохимиков в становление и развитие науки.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 15-18.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 13-15.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 5-8.

З А Н Я Т И Е № 2

ТЕМА: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ – Ι

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о физико-химических свойствах белка. Обучить методике выполнения цветных реакций на белки и аминокислоты. Освоить биуретовый метод определения концентрации белка.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Цветные реакции на белки и аминокислоты, химические механизмы.

2.2. Принципы методов количественного определения белков в растворе:

2.3. Клинико-диагностическое значение определения общего белка в сыворотке крови.

3. ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА: 3.1. Цветные реакции на белки и аминокислоты.

3.1.2. Нингидриновая реакция.

3.1.3. Ксантопротеиновая реакция.

3.2. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу..

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. – М.: Высш. шк., 1988. – С. 11-13, 18-20, 22-23. Работы 5, 7, 10, 11.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983. — С. 7 – 14. Работа: нингидриновая реакция (с. 10-11), 179.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 9-13. Работы 1(пункты 1, 2, 3,

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. История изучения белков.

2. Белки – важнейшие компоненты живых организмов. Содержание белков в тканях.

3. Аминокислотный состав белков; строение пептидов.

4. Форма и размеры белков, молекулярная масса, методы ее определения.

5. Физико-химические свойства белков, осаждение их из растворов.

6. Методы выделения и очистки белков. Разделение пептидов. Искусственный синтез пептидов.

7. Цветные реакции на белки и аминокислоты, их практическое применение.

8. Количественное определение белков в растворах и тканях.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 19-20, 22-37, 44-49.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 16-17, 19-32, 37-42.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 9-17, 36-42, 48-52.

З А Н Я Т И Е № 3

ТЕМА: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ — ΙΙ

ЦЕЛЬ: Изучить основные физико-химические свойства белков, уметь проводить реакции осаждения белка и объяснять их механизмы. Сформировать знания о структурной организации белков.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Факторы устойчивости белков в растворе.

2.2. Обратимое осаждение белков, факторы, механизмы.

2.3. Необратимое осаждение белков, (денатурация), факторы, механизмы.

2.4. Практическое использование обратимого и необратимого осаждения белков.

2.5. Представление о клинико-диагностическом значении протеинограммы сыворотки крови.

3.1. Разделение альбуминов и глобулинов яичного белка методом высаливания (пункты 2 и 3)

3.2. Осаждение белков HNO₃ (демонстрация)

3.3. Разделение белков методом электрофореза (демонстрация электрофореграмм и их анализ).

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. – М.: Высш. шк., 1988. – С. 24-25, 37. Работа 14 (пункты 2 и 3).

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983. — С. 26, 28-29, работа 73. С. 186-192.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 14-15. Работы 3 и 4.

1. Первичная структура белка, методы ее установления, роль пептидных связей.

2. Зависимость биологических свойств и видовой специфичности белков от первичной структуры.

3. Вторичная структура белка, ее виды, методы установления, роль водородных связей.

4. Третичная структура белка, методы ее установления, виды стабилизирующих связей.

5. Зависимость биологических свойств белков от третичной структуры. Денатурация белка, факторы, ее вызывающие, практическое использование.

6. Четвертичная структура белка, ее биологическое значение.

7. Представление о кооперативных взаимодействиях и мультимолекулярных структурах. Доменные белки.

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 47-48, 49-71.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 40-41, 42-60.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 18-29, 30-36.

З А Н Я Т И Е № 4

ТЕМА: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ — ΙΙΙ

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о биологических функциях белков. Освоить методику кислотного и ферментативного гидролиза белка.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Гидролиз белков и его типы, схема.

2.2. Контроль кислотного гидролиза (биуретовая реакция) и гидролиза белка трипсином.

2.3. Практическое использование гидролиза и белковых гидролизатов.

3.1. Кислотный и ферментативный гидролиз белков.

3.1.2. Гидролиз белков трипсином.

3.1.3. Контроль за полнотой гидролиза (биуретовая реакция).

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

1. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М., 1983. С. 15-17, 18-19. Работа 2.

2. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. – Биохимия, руководство. М., Высш. шк., 1988 — С. 52-53. Работа 26.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 16-18. Работы 5 и 6.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Биологически активные пептиды, классификация, представители. Глутатион.

2. Динамическое состояние нативного белка. Понятие комплементарность. Лиганды и функционирование белков.

3. Многообразие белков и их функции. Количественное определение белков по функциональным свойствам. Белковые препараты (гормоны, ферменты и т.д.).

4. Различие белкового состава органов и тканей. Изменение белкового состава в онтогенезе, при болезнях.

5. Простые белки, представители, характеристика, биологические функции.

6. Сложные белки, представители, характеристика, биологические функции.

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 20-22, 71-95.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 17-18, 60-76.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 29-30, 31-32, 42-45, 52-53.

З А Н Я Т И Е № 5

ТЕМА: Ф Е Р М Е Н Т Ы — Ι

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о природе, свойствах и механизмах действия ферментов. Отработать методические подходы к определению активности и изучению свойств ферментов.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Химическая природа ферментов, представление об активном центре.

2.2. Особенности ферментативного катализа и этапы ферментативной реакции.

2.3. Реакция, катализируемая амилазой. Принцип метода определения активности фермента.

2.4. Факторы, влияющие на активность амилазы (температура, активаторы, ингибиторы).

2.5. Принцип метода определения активности диастазы (амилазы) мочи по Вольгемуту. Единицы амилазной активности.

2.6. Диагностическое значение определения активности диастазы мочи.

3.1. Влияние температуры на активность амилазы.

3.2. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы слюны.

3.3. Определение активности амилазы (диастазы) мочи по Вольгемуту. (Методика прилагается).

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. – Биохимия, руководство. М., Высш. шк., 1988 — С. 60-61, 79-80. Работы 31 и 45.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. М., 1983. С. 64-66.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 21- 24. Работы 7, 8, 9.

Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинической практике с целью диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эпидемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита.

Ход работы: Берут 10 пронумерованных пробирок, приливают в каждую по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл исследуемой мочи. Содержимое этой пробирки перемешивают, несколько раз втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси и переносят ее во 2-ю пробирку и т.д. до 10-й пробирки. Из 10-й пробирки отбирают 1 мл смеси и выливают. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия, по 2 мл 0,1% раствора крахмала и, перемешав, все пробирки помещают в термостат на 15 мин. при 45 о С. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой и ставят по порядку в штатив. Прибавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора йода и перемешивают. При реакции с йодом жидкость в пробирках окрашивается в желтоватый, розовый и фиолетовый цвет. Отмечают пробирку с наибольшим разведением мочи, при котором произошло полное расщепление крахмала (желтая окраска с йодом). Полученные данные заносят в таблицу.

Расчёт: Предположим, что полное расщепление крахмала произошло в первых четырёх пробирках. В четвёртой пробирке разведение мочи 1 : 16. Следовательно:

1 /₁₆ мл мочи расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала

1 мл неразведенной мочи расщепит Х мл 0,1% раствора крахмала

2 · 1 ·16

X = ———— = 32 мл 0,1 % раствора крахмала.

Следовательно, активность амилазы (диастазы) мочи равна 32 ед.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. История открытия и изучения ферментов.

2. Химическая природа ферментов. Активный и аллостерический центры.

3. Кофакторы ферментов: ионы металлов, коферменты. Коферментные функции витаминов.

4. Механизмы действия ферментов.

5. Особенности ферментативного катализа. Специфичность действия ферментов.

6. Классификация и номенклатура ферментов.

8. Единицы измерения активности и количества фермента.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 114-134, 142-143, 157-158, 159-163.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 92-108, 114-115, 124-125, 126-129.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 53-58, , 61-73, 76-77, 81-83, 89-90.

З А Н Я Т И Е № 6

ТЕМА: Ф Е Р М Е Н Т Ы — ΙΙ

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о регуляции ферментативной активности. Изучить действие липазы и влияние желчи на активность фермента.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Реакция, катализируемая липазой, ее роль в процессе пищеварения.

2.2. Факторы, активирующие липазу в кишечнике.

2.3. Изменение скорости ферментативной реакции во времени.

2.4. Принцип метода количественного определения активности липазы.

3.1. Кинетика действия липазы. Влияние желчи на активность липазы.

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. — М.: Высш. шк., 1988. — С. 146-148. Работа 82.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983. – С. 72.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 25 — 26. Работа 10.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Кинетика ферментативных реакций, анализ и графическое изображение уравнений Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка.

2. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, концентраций субстрата и фермента.

3. Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования: обратимое (конкурентное и неконкурентное), необратимое.

4. Лекарственные препараты-ингибиторы ферментов.

5. Механизмы регуляции ферментативной активности.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 134-142, 143-157.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 108-114, 115-124.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 73-76, 78-81, 84-89.

З А Н Я Т И Е № 7

ТЕМА: Ф Е Р М Е Н Т Ы — III

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о клинических аспектах энзимологии и закрепить знания о структуре и функциях белков и ферментов.

СЕМИНАРСКОЕ ЗАНЯТИЕ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

3. Самостоятельная аудиторная работа в соответствии с предложенными заданиями.

4. Решение и обсуждение ситуационных задач.

5. Контроль выполнения самостоятельной работы.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты.

2. Определение ферментов в плазме крови с диагностической целью: причины ферментемии, происхождение ферментов плазмы крови.

3. Изменение активности ферментов при патологии. Наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные) энзимопатии.

4. Применение ферментов для лечения болезней и как аналитических реагентов в лабораторной диагностике. Иммобилизованные ферменты.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 163-168, 439, 579-580, 615-616.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 129-132, 343-344, 446-447, 480.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 90-92.

З А Н Я Т И Е № 8

ТЕМА: КОНТРОЛЬНОЕ ЗАНЯТИЕ «БЕЛКИ. ФЕРМЕНТЫ»

1. История изучения белков.

2. Белки – важнейшие компоненты живых организмов. Содержание белков в тканях.

3. Аминокислотный состав белков; строение пептидов. Гидролиз белка.

4. Форма и размеры белков, молекулярная масса, методы ее определения.

5. Физико-химические свойства белков, осаждение их из растворов.

6. Методы выделения и очистки белков. Разделение пептидов. Искусственный синтез пептидов.

7. Цветные реакции на белки и аминокислоты, их практическое применение.

8. Количественное определение белков в растворах и тканях. Клинико-диагностическое значение определения общего белка в сыворотке крови.

9. Первичная структура белка, методы ее установления, роль пептидных связей.

10. Зависимость биологических свойств и видовой специфичности белков от первичной структуры.

11. Вторичная структура белка, ее виды, методы установления, роль водородных связей.

12. Третичная структура белка, методы ее установления, виды стабилизирующих связей.

13. Зависимость биологических свойств белков от третичной структуры. Денатурация белка, факторы, ее вызывающие, практическое использование.

14. Четвертичная структура белка, ее биологическое значение.

15. Представление о кооперативных взаимодействиях и мультимолекулярных структурах. Доменные белки.

16. Биологически активные пептиды, классификация, представители. Глутатион.

17. Динамическое состояние нативного белка. Понятие комплементарность. Лиганды и функционирование белков.

18. Многообразие белков и их функции. Количественное определение белков по функциональным свойствам. Белковые препараты (гормоны, ферменты и т. д.).

19. Различие белкового состава органов и тканей. Изменение белкового состава в онтогенезе, при болезнях.

20. Методы выделения и очистки белков. Белковые препараты (гормоны, ферменты и т.д.).

21. Простые белки, представители, характеристика, биологические функции.

22. Сложные белки, представители, характеристика, биологические функции.

23. История открытия и изучения ферментов.

24. Химическая природа ферментов. Активный и аллостерический центры. Механизмы действия ферментов.

25. Кофакторы ферментов: ионы металлов, коферменты. Коферментные функции витаминов.

26. Особенности ферментативного катализа. Специфичность действия ферментов.

27. Классификация и номенклатура ферментов.

29. Единицы измерения активности и количества ферменты.

30. Кинетика ферментативных реакций, анализ и графическое изображение уравнений Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка.

31. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН, концентраций субстрата и фермента.

32. Ингибиторы и активаторы ферментов. Типы ингибирования: обратимое ((конкурентное и неконкурентное), необратимое.

33. Лекарственные препараты – ингибиторы ферментов.

34. Механизм регуляции ферментативной активности.

35. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты.

36. Определение ферментов в плазме крови с диагностической целью: причины ферментемии, происхождение ферментов плазмы крови.

37. Изменение активности ферментов при патологии. Наследственные (первичные) и приобретенные (вторичные) энзимопатии. Клинико-диагностическое значение исследования активности амилазы (диастазы) мочи.

38. Применение ферментов для лечения болезней и как аналитических реагентов в лабораторной диагностике. Иммобилизованные ферменты.

ТЕМА: СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о строении нуклеиновых кислот и их функциях. Провести гидролиз нуклеопротеинов и освоить качественные реакции определения продуктов гидролиза.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Нуклеопротеины, их представители, биологическая роль.

2.2. Схема гидролиза нуклеопротеинов.

2.3. Сущность качественных реакций на продукты гидролиза нуклеопротеинов.

3.1. Гидролиз нуклеопротеинов. Реакции на компоненты нуклеопротеинов в гидролизате:

3.1.1. Биуретовая реакция на полипептиды.

3.1.2. Серебряная проба на пуриновые основания.

3.1.3. Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу.

3.1.4. Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. — М.: Высш. шк., 1988. — С. 94-96. Работа 53.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983. – С. 29-34.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 27-28. Работа 11.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. История открытия и изучения нуклеиновых кислот.

2. Химическая природа нуклеиновых кислот. Различия между ДНК и РНК.

3. Структура и функция ДНК.

4. РНК, виды, особенности структурной организации, биологические функции.

5. Денатурация и ренатурация ДНК. Гибридизация нуклеиновых кислот.

6. Роль белков в структурной организации нуклеиновых кислот. Нуклеопротеины. Структура хроматина. Строение рибосом эукариот.

7. Особенности организации генома человека.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 86-88, 96-113, 513-515, 517-520.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 71-73, 77-91, 402, 403-406..

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 92-105.

З А Н Я Т И Е № 10

ТЕМА: БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о биосинтезе нуклеиновых кислот. Выполнить выделение дезоксирибонуклеопротеинов из биологического материала. Освоить метод количественного определения мочевой кислоты в моче.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Сравнительное содержание ДНК в тканях.

2.2. Принцип метода выделения дезоксирибонуклеопротеинов из тканей.

2.3. Сущность качественной реакции на ДНК.

2.4. Происхождение мочевой кислоты в организме. Клинико-диагностическое значение исследования мочевой кислоты в крови и моче.

2.5. Принцип метода количественного определения мочевой кислоты в моче.

3.1. Выделение дезоксирибонуклеопротеинов из тканей животных (демонстрация).

3.2. Определение мочевой кислоты в моче.

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. — М.: Высш. шк., 1988. — С. 97-98, 109-110. Работы 54 и 61.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983. – С.35-36, 210-211.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 29-30. Работа 12.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Биосинтез ДНК (репликация) у эукариот, общая схема, ферменты, роль ДНК-полимераз. Регуляция синтеза ДНК.

2. Повреждения ДНК, типы, способы репарации, эксцизионная репарация.

3. Обратная транскрипция, схема, биологическая роль. Представление об онкогенах.

4. Биосинтез РНК (транскрипция) у эукариот, этапы, схема, роль ДНК-зависимых РНК-полимераз.

6. Процессинг матричных, рибосомных, транспортных РНК.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 478-495.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 377-387.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 105-115, 135-139.

З А Н Я Т И Е № 11

ТЕМА: БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ

ЦЕЛЬ: Сформировать знания о биосинтезе белков.

СЕМИНАРСКОЕ ЗАНЯТИЕ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Самостоятельная аудиторная работа в соответствии с предложенными заданиями.

3. Решение и обсуждение ситуационных задач.

4. Контроль выполнения самостоятельной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Основной постулат молекулярной биологии.

2. Генетический код и его свойства.

3. Образование и строение аминоацил-т РНК. Адапторная функция тРНК.

4. Синтез белка (трансляция) у эукариот, этапы, схема.

5. Посттрансляционные изменения белков, значение фолдинга белков.

6. Регуляция синтеза белка у эукариот. Теория оперона (лактозный оперон у прокариот).

7. Антибиотики — ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот и белков.

8. Представление о технологии рекомбинантнных ДНК (генной инженерии). Использование ее достижений в медицине.

Л И Т Е Р А Т У Р А:

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 496-498, 509-544.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 388-390, 399-422.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 116-124, 126-129, 156-159.

Конспект лекций.

З А Н Я Т И Е № 12

ТЕМА: ВВЕДЕНИЕ В МЕТАБОЛИЗМ.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. Сукцинатдегидрогеназная реакция, принцип определения активности.

2.1. Конкурентное ингибирование сукцинатдегидрогеназы.

2.2. Цитохромоксидаза, биологическая роль.

2.4. Принцип метода качественного определения активности цитохромоксидазы.

3.1. Определение активности сукцинатдегидрогеназы.

3.2. Определение активности цитохромоксидазы.

4. Контроль выполнения лабораторной работы.

5. Письменная контрольная работа по теоретическому разделу.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. — М.: Высш. шк., 1988. — С. 111-114. Работы 62 и 63.

2. Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина. 1983. – С. 91-92, 102-104.

3. Лукашик Н. К., Климович В. В. Руководство к лабораторным занятиям

по биологической химии. – Гродно, 2000. – С. 31-33. Работы 13 и 14.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

1. Представление о метаболизме и метаболических путях.

2. Методы изучения обмена веществ. Использование изотопов.

3. Специфические и общие пути катаболизма.

4. Метаболиты в норме и при патологии. Конечные продукты метаболизма.

5. Состав и строение биологических мембран.

6. Общие свойства и функции биологических мембран. Липосомы.

8. Механизмы мембранного транспорта веществ.

9. Патология мембран, роль лизосом.

Л И Т Е Р А Т У Р А :

1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 3-е изд. – М.: Медицина, 1998. – С. 298-305, 406-408.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – 2-е изд. – М.: Медицина, 1990. – С. 204, 208-212, 316-317.

3. Николаев А. Я. Биологическая химия. – М.: Высш. шк., 1989. – С. 160-164, 172-198.

З А Н Я Т И Е № 13

ТЕМА: ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН — I

ЦЕЛЬ: Сформировать знания об основах биоэнергетики клетки, представление о макроэргах тканей (АТФ, креатинфосфат) и принципах их количественного определения.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

СОДЕРЖАНИЕ ЗАНЯТИЯ:

1. Разбор вопросов теоретического раздела.

2. Контрольные вопросы к лабораторной работе:

2.1. АТФ, строение, пути синтеза, биологическая роль.

Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим.

Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций.

Папиллярные узоры пальцев рук — маркер спортивных способностей: дерматоглифические признаки формируются на 3-5 месяце беременности, не изменяются в течение жизни.

Организация стока поверхностных вод: Наибольшее количество влаги на земном шаре испаряется с поверхности морей и океанов (88‰).

источник