Посев мочи: Мочу в лабораторию доставляют в стерильной тёмной баночке в количестве 3 – 5 мл (после тщательного туалета наружных половых органов). Подписываем на чашке номер, присвоенный в регистратуре. Сеется на кровяной агар по методу Голда. Мочу чуть взбалтываем, открываем и обожжённой петлёй (остудить) берём каплю. Наносим на середину чашки и несколько раз проводим по середине чашки, растирая каплю, затем неотрывными движениями делаем не менее 40 штрихов вверх и обжигаем петлю. Остужаем и наносим четыре штриха поперёк того сектора. Петлю обжигаем, остужаем и наносим ещё 4 штриха, не касаясь большого сектора, поперёк первых штрихов. Петлю обжигаем, остужаем и по вторым 4-м штрихам наносим 4 штриха, не касаясь большого поля. Петлю обжигаем, а чашку закрываем, убираем в термостат, баночку сбрасываем в 3% хлорамин.
39. Методика отбора проб на стерильность.
Смыв делают стерильным тампоном который находится в пробирки залитый 1% пептонной водой с гипосульфатом – 0,5% (для нейтрализации дез. р-ров) 4 – 5 мл.
Порядок взятия смывов: Смывы берутся с любой поверхности площадью 10 см. После чего тампон опускают в пробирку, стараясь не задеть края пробирки. Взятая проба регистрируется и отправляется в лабораторию для дальнейших исследований. В лаборатории смывы сеют на среду Эндо с помощью петли. С этих забранных смывов берут 0,2 мл 1% пептонной воды и вносят в среду обогащения и солевой бульон 5 мл, затем ставят в термостат на 18-24 часа при температуре 37 градусов. Через сутки делают повторный высев: с 1% пептонной воды на среду Эндо, а с солевого бульона на ЖСА (пробирки сбрасываем), чашки ставим в термостат на 18-24 часа. Если есть рост колоний, то с материалом работает врач. Если нет колоний, то Эндо в убивку, а ЖСА ещё на 24 часа в термостат.
40. Методика проведения посева отделяемого из глаз.
Предварительная подготовка включает отмену всех лекарственных препаратов и лечебных процедур за 5-8 часов.Забор материала проводится после сна, до умывания, из мест наибольшего скопления патологического отделяемого с помощью стерильного ватного зонда-тампона, отдельно для каждого глаза.При конъюнктивите предварительно слегка оттягивают веко, чтобы ресницы не коснулись тампона. Гной собирается движением от наружного угла глаза к внутреннему.При блефарите сухие гнойные корочки снимают глазным пинцетом. Тампоном берут мазок из имеющихся эрозий.При кератите требуется предварительное обезболивание с помощью капель с анестетиком. Мазок берется сухим стерильным тампоном.При ношении контактных линз мазок также берется и с их внутренней поверхности.После взятия мазка тампон помещают в пробирки (отдельно для каждого глаза), подписывают и доставляют в лабораторию в кратчайшие сроки. При необходимости хранения во время длительной транспортировки обеспечиваются температурные условия не выше +8 градусов по Цельсию.
Бактериоскопический. Изучение с помощью предварительного окрашивания мазка и его микроскопии микробного состава отделяемого из глаза. С помощью этого метода можно в кратчайшие сроки выявить хламидию, дифтерийную палочку, грибы рода Aspergillus и Candida, гонококков, кишечную палочку, стрептококков, стафилококков.Бактериологический (посев на разнообразные питательные среды для получения роста колоний возбудителя заболевания). Так как на конъюнктиве глаза условно-патогенные микроорганизмы обитают в небольших количествах у всех здоровых людей, для уточнения природы гнойного воспаления часто требуется не только выделение всех микробов, найденных в мазке, но и подсчет их количества. Только таким образом можно подтвердить, что возбудителем заболевания стал активизировавшийся представитель собственной микрофлоры, например, Pseudomonas aeruginosa, коагулазонегативный стафилококк, Moraxella catarrhalis, грибки, Klebsiella и другие.Определение чувствительности к антибактериальным препаратам.
источник
Классы МПК:
C12Q1/04 установление присутствия и(или) вида микроорганизма; использование селективных сред для испытания антибиотиков или бактерицидов; составы, содержащие химический индикатор для этих целей
Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения обсемененности мочи, секрета предстательной железы, эякулята бактериями, и может быть использовано для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека. Способ осуществляют путем посева мочи, секрета предстательной железы, эякулята на плотные питательные среды, дополнительно осуществляют посев этих субстратов на полужидкую среду Блаурокка и бульон Шадлера в последовательных разведениях от 10 -1 до 10 -10 и выявляют неклостридиальные анаэробные бактерии. Изобретение позволяет повысить точность дифференциальной диагностики и сократить время исследования. 3 табл., 2 пр.
Изобретение относится к бактериологии, а именно к способам определения обсемененности биологического материала (мочи, секрета предстательной железы, эякулята) микроорганизмами, и может быть использовано для установления диагностической значимости микроорганизмов при местных инфекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиотических состояниях урогенитального тракта человека.
Анаэробы (А) (греч. отрицательная приставка an- + a r воздух + b [ios] жизнь) — микроорганизмы, развивающиеся при отсутствии в окружающей их среде свободного кислорода. Обнаруживаются практически во всех образцах патологического материала при различных гнойно-воспалительных заболеваниях, являются условно-патогенными, иногда патогенными. К неклостридиальным А. относят грамотрицательные и грамположительные бактерии палочковидной или шаровидной формы: бактероиды, фузобактерии, вейллонеллы, пептококки, пептострептококки, пропионибактерии, эубактерии и др.
За последние годы среди возбудителей урогенитальных инфекций значительно возрос удельный вес так называемых неклостридиальных анаэробов. Интенсивное развитие анаэробной техники культивирования позволило достичь определенных успехов в изучении проблемы неклбстридиальной анаэробной инфекции. Эти успехи связаны с этиологической расшифровкой указанных инфекций, проведением клинико-бактериологических исследований с целью определения критериев клинической диагностики, разработкой оптимальных методов хирургического и антибактериального лечения, изучением механизмов патогенеза неклостридиальной анаэробной инфекции.
Несмотря на достигнутые успехи многие вопросы диагностики, патогенеза, клиники и лечения неклостридиальной анаэробной инфекции далеки от решения. В отечественной практике как для бактериологов, так и для клиницистов проблема борьбы с неклостридиальной анаэробной инфекцией — одна из наименее изученных.
Установление этиологии заболевания облегчает и уточняет постановку диагноза. Бактериологический посев — метод исследования биологического материала (кровь, моча, кал и пр.), взятого у пациента и помещенного на искусственную питательную среду, способствующую росту и размножению возбудителя заболевания. При исследовании можно выявить не только факт наличия возбудителя, но и его концентрацию. Таким образом можно исследовать кроме уже перечисленного спинномозговую жидкость (ликвор), мокроту, желчь, отделяемое из зева, носа, глаз, дыхательных путей, половых органов, ран. После забора материала производят его посев на специальные питательные среды, через 24-48-72 часа оценивают результаты. Исследование дает положительные результаты уже в первые дни болезни. Однако окончательный ответ лаборатория при большинстве инфекционных болезней сообщает лишь через 4-6 дней, а при бруцеллезе, туберкулезе — через 3-4 недель. Это зависит от сроков, требующихся для роста микроорганизмов и их идентификации (биохимической и антигенной). Каждый микроб для своего роста требует соответствующей питательной среды. В зависимости от того, какой микроб предполагают выделить (что определяется при клиническом и эпидемиологическом обследовании больного), выбирают соответствующую питательную среду. Иногда посев производят одновременно на несколько питательных сред.
Бактериологические посевы позволяют не только определить виды микробов, провоцирующих то или иное заболевание, но и подобрать эффективные антибиотики (определить чувствительность микробов к ним), которые помогут выздоровлению. Сложность антибактериальной терапии инфекций с участием неспорогенных анаэробов связана с тем, что эти инфекции, как правило, имеют полимикробный характер, обусловленный как анаэробным, так и аэробным компонентами. Вместе с тем известно, что антибактериальные спектры ряда антибиотиков, широко используемых в практике, для аэробов и анаэробов не совпадают.
В ряде случаев имеет значение не сам факт обнаружения тех или иных микроорганизмов, а их количество. Часто количество играет роль и для прогноза заболевания, характера лечения. Так, например, в мочевом пузыре в норме моча стерильна, но во время прохождения через нижнюю треть мочеиспускательного канала происходит ее контакт с нормальной микрофлорой, и о наличии патологического процесса говорят только в том случае, когда титр возбудителя (его количество) составляет более 10 3 КОЕ/мл.
Неверная оценка результатов бактериологического исследования, не обусловленная человеческим фактором, может быть вызвана следующими причинами:
1. Переход бактерии в некультивируемое состояние (близкое к анабиозу) при пересеве или в организме.
2. Образование L-форм бактерий (бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки, но способные реверсировать, возвращаться в исходную форму. L-формы образуются под действием антибиотиков, ферментов и т.д.).
3. Более низкая способность патогенного микроорганизма расти на питательных средах и маскировка оного быстрорастущими микроорганизмами.
4. Активация бактериофага (вируса бактерий) в ответ на изменение условий культивирования (в этом случае патогенные бактерии могут лизироваться).
5. Патогенный изолят может быть ауксотрофным по какому-либо питательному элементу (то есть неспособным самостоятельно усваивать какое-либо вещество и растущим только в присутствии бактерий, обладающих соответствующими ферментативными системами). В этом случае чистая культура не может быть получена в принципе по причине невозможности самостоятельного роста на обычных питательных средах /Ведущие методические проблемы в бактериологических исследованиях и новые подходы к.б.н. Афонюшкин В.Н., сектор болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ, к.в.н. Коптев В.Ю. СибАгроТрейд/.
Недостатком описанной методики является использование питательных сред в различных их физических состояниях (плотная и жидкая), которые используются только для культивирования бактероидов. На этой среде не культивируются эубактерии, пропионибактерии, вейлонеллы, фузобактерии и другие представители неклостридиально-анаэробных бактерий, что сужает спектр микроорганизмов, причастных к развитию заболевания. Данное обстоятельство влияет и на результаты лечения.
Известен способ определения обсемененности патогенными микобактериями окружающей среды (Патент РФ № 2115734, 20.07.1998). В посевах патологического материала после соответствующей деконтаминации при выявлении колоний дрожжей их окрашивают по Цилю-Нильсену с последующим выявлением внутриклеточно растущих патогенных микобактерий.
Недостатком данной методики является выявление только грибково-микобактериальных ассоциаций микобактерий, выделяются в ассоциациях не только с грибами, но и с условно-патогенными микроорганизмами, простейшими и вирусами. В данном аналоге эти ассоцианты не учитываются.
Известен способ диагностики пиелонефрита у детей (Патент РФ № 2115124, 27.10.2002). Определяют в моче в острой фазе заболевания до назначения антибиотикотерапии возбудителей бактериальной природы, проводят выделение из мочи с помощью полимеразной цепной реакции ДНК хламидий, микоплазм, вирусов простого герпеса, Эпштейна-Барр, цитомегалии и вирусов папилломы человека и при выявлении обсемененности мочи бактериями в количестве 100 тыс. КОЕ/мл и более и ДНК вышеперечисленных микроорганизмов диагностируют хронический пиелонефрит. Посев мочи производят секторным способом на следующие питательные среды: кровяной агар, желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро. Для этого вначале на пластинчатые среды стандартной бактериологической петлей в сектор А производят посев исследуемого материала в виде одного штриха, а затем после прожигания петли делают 4 штриховых посева из сектора А в сектор В и аналогичным образом из сектора В в сектор С, а затем в сектор D. Через 18-24 часа инкубирования в термостате при 37°С подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, а затем производят определение степени бактериурии по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов в 1 мл мочи соответственно таблице, представленной в справочнике Меньшикова В.В. (1987).
Недостатком описанной методики является то, что исследование проводится только у детей, необходимость выполнения ПЦР мочи на поиск ДНК ряда вирусов, что делает исследование сложным, дорогим, применимым в научно-исследовательских центрах. Посев мочи проводят стандартными микробиологическим методом, не позволяющим выделять широкий спектр неклостридиально-анаэробных бактерий, многие виды аэробных бактерий.
Известен способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека (Патент РФ № 2260054, 10.09.2005), который осуществляют путем забора исследуемого материала, его посева на селективные питательные среды, выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов, определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов. К нормальной микрофлоре урогенитального тракта человека относят микроорганизмы, не обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов или обладающие способностью к инактивации антимикробного белка тромбоцитов 20% и менее.
Недостатком описанной методики является то, что необходимо выделять у каждого вида микроорганизма антимикробный фактор тромбоцитов и по наличию его в определенной концентрации в каждом из микробов или отсутствию можно судить о том, агрессивен ли микроб или он относится к нормальной флоре. Методика сложная, трудоемкая и не применима в широкой практике клинических лабораторий, а только в научно-исследовательских целях. При этом исследуются известные патогенные микроорганизмы.
Известен способ дифференциальной диагностики воспалительных процессов в мочеполовых путях у мужчин (Патент РФ № 2153672, 27.07.2000). Предлагаемый способ состоит в выделении, идентификации и определении концентрации условно-патогенных бактерий: аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных, находящихся в исследуемых порциях мочи, секрета предстательной железы и эякуляте. Посев проб мочи осуществляют методом секторных посевом (По Голду-Родоману) на чашки Петри с кровяным агаром, а также средами Эндо и Сабуро. По капле материала помещают в селенитовую или магниевую среду в соотношении 1:9 для накопления энтеропатогенных бактерий. Посевы помещают в термостате на 18-24 часа при 35-37 градусах. По окончании инкубации производят количественный учет и идентификацию микроорганизмов.
Недостатком данного метода является то, что микробиологическое исследование мочи производится на стандартные питательные среды, поэтому выделяются известные патогенные микроорганизмы и определяется их концентрация в моче не по абсолютному уровню, а по относительным коэффициентам, что достаточно сложно для интерпретации результатов в повседневной лабораторной практике.
Данный способ принят за прототип. Указанные недостатки прототипа устраняются в заявляемом изобретении.
Основной задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение точности определения исследования, а также упрощение процедуры выполнения способа.
Поставленная задача решается тем, что для определения бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы, эякулята на плотные питательные среды и выявления бактерий дополнительно осуществляют посев этих субстратов на полужидкую среду Блаурокка и бульон Шадлера в последовательных разведениях от 10 -1 до 10 -10 и выявляют неклостридиальные анаэробные бактерии.
Неожиданный технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в повышении точности определения бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы и эякулята при использовании именно сред Блаурокка и Шадлера, т.к.:
— данные среды никогда и никем не использовались при проведении бактериологического исследования мочи, секрета предстательной железы и эякулята;
— среда Блаурокка существует только в полужидком состоянии и не бывает в твердом состоянии. Среда Блаурокка в различных модификациях предназначена для выделения неклостридиально-анаэробных бактерий, в частности, при проведении бактериологического исследования микрофлоры влагалища и толстого кишечника. Ее основу составляет печеночный бульон, который необходим для адсорбции кислорода, полужидкий агар не допускает кислород в толщу среды, входящие в состав среды углеводы обеспечивают анаэробный гликолиз (состав среды приведен, в частности, в «Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования», М.: Медицина, 1982. — С.78;
— к полужидким средам также относят среды Вильсона-Блера и Китта-Тароцци, но они предназначены для культивирования различных видов клостридий и используются, в частности, при микробиологической диагностике газовой гангрены и столбняка. При развитии газовой гангрены и столбняка бактериологическому исследованию подлежат раневое отделяемое и кусочки пораженных тканей, перевязочный и шовный материал, секционный материал, при подозрении на столбняк у женщины после родов или аборта выделение из матки. Среда Вильсона-Блера также используется для выделения клостридий из кишечника при проведении бактериологического исследования фекалий с целью определения дисбиотических сдвигов («Медицинская микробиология». Учебное пособие. СПб., 1999. — С.148-153);
— бульон Шадлера относится к жидким средам и в своем составе также содержит необходимые факторы роста для неклостридиально-анаэробных бактерий и используется для их обнаружения во влагалище или шейки матки (Л.А.Тоноян «Тактика ведения родов при преждевременном излитии околоплодных воз», автореферат канд. дис., М., 2007);
— для выделения и идентификации неклостридиально-анаэробных бактерий обычно рекомендуют использовать плотные питательные среды: анаэробный кровяной агар и среды, содержащие антибиотики, желчь, налидиксовую кислоту. Сроки культивирования могут составлять до 7 суток («Медицинская микробиология». Учебное пособие. СПб., 1999. — С.155-159), тогда как в используемых средах Блаурокка и Шадлера учет роста неклостридиально-анаэробных бактерий происходит через 24-48 часов, что сокращает время исследования в несколько раз.
Данное преимущество можно также отнести к неожиданному новому техническому результату.
Обычно при проведении бактериологического исследования мочи неклостридиально-анаэробные бактерии не определяются, так как это не входит в стандарт исследования (приказ № 535 от 22 апреля 1985). Степень бактериурии определяется только на плотных питательных средах. Со следующим учетом результатов: при росте от 10 до 100 колоний на чашке кровяного агара количество микроорганизмов равно 10 3 КОЕ/мл, от 100 до 1000 — 10 4 КОЕ/мл, более 1000 — 10 5 КОЕ/мл (Методики клинических лабораторных исследований. Справочное пособие по ред. В.В.Меньшикова. — М.: Лабора, 2009. — Т.3. — С.66). Предлагаемый метод последовательных разведений позволит точно определить уровень бактериурии, начиная с минимального (10 1 ) до максимального (10 10 ). Особенно важно для клинического врача пограничные уровни (10 2 , 10 3 ). При определении уровня бактериурии на плотных питательных средах учет начинается с 10 3 и не учитывает 10 2 , но при наличии у больного клинических симптомов, изменений в общем анализе мочи, определение уровня бактериурии ниже формально допустимого значения является очень важным, так как определяет дальнейшую тактику лечения, в частности назначения антибактериальной терапии. Однако в наших работах («Микробный спектр мочи молодых здоровых женщин». — Журн. Урология. — № 5. — 2010. — С.7-10, «Этиологическая структура и антибиотикочувствительность микроорганизмов, выделенных при хроническом бактериальном простатите». — Consilium medicum. — Т.12. — 2010. — С.5-7, «Бактериальная микст-инфекция у женщин с хроническим рецидивирующим циститом». — Журн. Микробиол. — 2011. — № 1. — С.8-12) показано, что неклостридиально-анаэробные бактерии выделяются в моче как в норме, так и при различной урологической патологии и не учитываются при рутинном бактериологическом исследовании мочи. Секрет предстательной железы и эякулят вообще не исследуют на неклостридиально-анаэробные бактерии. В ходе наших исследований удалось установить, что для их выделения на таких субстратах, как моча, секрет предстательной железы и эякулят, можно использовать среды Блаурокка и Шадлера, что повышает точность диагностики и сокращает время исследования в несколько раз.
Материал для бактериологического исследования (моча, секрет предстательной железы, эякулят) берут в зависимости от формы заболевания (таблица 1).
Таблица 1
Форма заболевания
Материал на исследование
Острый цистит
Средняя порция утренней мочи
Простатит
Секрет предстательной железы
Мужское бесплодие
Эякулят
Используемые в заявляемом способе среды (Блаурокк и Шадлер) по физическому состоянию являются полужидкими. И точный подсчет микроорганизмов возможен только при проведении десятикратных разведений. Если использовать одно разведение (одну пробирку с питательной средой), можно констатировать лишь присутствие микроорганизмов, а не их количественный показатель. Наши исследования показали, что использование заявляемой методики разведения для определения анаэробных бактерий значительно повышает точность исследования, в то время как при стандартном посеве результаты бактериологического исследования далеко не всегда совпадали с результатами клинического и параклинических обследований.
Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения.
Способ обнаружения неклостридиально-анаэробных бактерий (НАБ) осуществляют следующим путем. На исследование забирают 10 мл средней порции утренней мочи или 0,5 мл эякулята или секрета предстательной железы. Готовят десятикратные разведения следующим образом. Расставляют 9 пробирок в штатив. В пробирку № 1 стерильной пипеткой объемом, например, 1 мл с неповрежденным концом вносят 9 мл тиогликолевого буфера и 1 мл исследуемой мочи. Пробирку аккуратно встряхивают. Это первое десятикратное разведение. Далее, в расставленные в штативе пробирки ( № 2-9) стерильной пипеткой вносят по 4,5 мл тиогликолевого буфера. Из первого разведения стерильной пипеткой объемом, например, 1 мл с неповрежденным концом переносят 0,5 мл материала в пробирку № 2. При этом кончик пипетки прислоняют к внутренней стенке пробирки, не касаясь содержащейся в ней жидкости. Пробирку № 2 аккуратно встряхивают. После этого пипетку сбрасывают. Берут другую такую же пипетку и из пробирки № 2 переносят 0,5 мл в следующую пробирку, соблюдая те же правила, пока не закончат подготовку всех разведений.
Из каждого разведения стерильной пипеткой с неповрежденным концом объемом, например, 1 мл делают посевы по 1,0 мл на бульон Шадлера (HIMEDIA, Индия) и среду Блаурокка (Ростовский НИПЧИ).
В таблице 2 представлены данные по составляющим методики.
Таблица 2
Питательные среды
Разведения
Количество материала
среда Блаурокка (Ростовский НИПЧИ)
10 -1 -10 -10
1,0 мл
бульон Шадлера (HIMEDIA, Индия)
10 -1 -10 -10
1,0 мл
Учет результатов осуществляют согласно методике, описанной в работе Меньшиков В.В. // Методики клинических лабораторных исследований. — М.: Лабора. — 2009. — С.80.
Больная Ж-ова, 26 лет. В течение 5 лет беспокоят симптомы нарушенного мочеиспускания (боли при микции, частые императивные позывы) в виде эпизодов острого цистита. Неоднократные приемы антибиотиков в течение трех-пяти дней (норфлоксацин, макролиды, тетрациклины, фосфомицин), назначенные в соответствии с антибиотикограммой, купировали симптомы, однако рецидивы инфекции нижних мочевых путей случались до 4-5 в год. Бактериологическое исследование средней порции мочи, проведенное по стандартной методике, выявило моноинфекцию, представленную Esherichia coli в количестве 10 2 КОЕ/мл. Однако низкая концентрация этого микроорганизма в моче не могла объяснить причины столь частых эпизодов цистита. Урологическим обследованием в РостГМУ были исключены обструктивные и нейрогенные поражения нижних мочевых путей. Тогда было решено провести расширенное бактериологическое исследование средней порции мочи на средах Блаурокка и Шадлера. При этом из мочи была выделена микст-инфекция с превалирующей концентрацией неклостридиально-анаэробных бактерий (НАБ): Bacteroides sp. (10 5 КОЕ/мл), Peptostreptococcus sp. (10 6 КОЕ/мл) и с незначительным удельным весом Esherichia coli (10 2 КОЕ/мл). Было проведено лечение больной в соответствии с полученной антибиотикограммой при очередном эпизоде цистита в течение двух недель. Уже к 7 дню наступила нормализация общего анализа мочи. Бактериологическое исследование средней порции мочи на среды Блаурокка и Шадлера на 14 день лечения выявило снижение концентрации НАБ: Bacteroides sp. (10 3 КОЕ/мл), Peptostreptococcus sp. (10 2 КОЕ/мл). Контрольное бактериологическое исследование средней порции мочи через 3 и 6 месяцев выявило отсутствие Esherichia coli и наличие Bacteroides sp. (10 1 КОЕ/мл), что соответствует формально нормативным показателям. Больную наблюдали в течение одного года, ни одного эпизода инфекции нижних мочевых путей не отмечено. Выздоровление.
Больной Ю-ев, 37 лет. Трижды лечился в муниципальных больницах в течение последних 2 лет по поводу обострения хронического бактериального простатита. При бактериологическом исследовании мочи и секрета простаты (проба Мирса-Стеми), по стандартной методике культурального исследования определялись микробы: из 1-й порции мочи были выделены Staphylococcus epidermidis 10 1 КОЕ/мл и Corynebacterium sp. 10 2 КОЕ/мл, из 2-й порция мочи: Staphylococcus epidermidis 10 1 КОЕ/мл и Corynebacterium sp. 10 2 КОЕ/мл, из 4-й порции мочи: Staphylococcus epidermidis 10 5 КОЕ/мл и Corynebacterium sp. 10 4 КОЕ/мл, из секрета простаты (3-й порции) были выделены: Staphylococcus epidermidis 10 4 КОЕ/мл и Corynebacterium sp. 10 5 КОЕ/мл. Проводились курсы антибактериальной терапии (фторхинолоны, тетрациклины, цефалоспорины) в соответствии с антибиотикограммой, приносившие субъективные улучшения (уменьшение болей в промежности, снижение частоты мочеиспускания). Однако нормализация анализов мочи и секрета простаты не наступила. При обращении в РостГМУ было решено выполнить бактериологическое исследование с дополнительным посевом 4-й порции мочи и секрета простаты на полужидкие среды Блаурокка и Шадлера. Было установлено, что наряду с ранее выявляемой аэробной флорой (Staphylococcus epidermidis и Corynebacterium sp.), выделенной при стандартной методике посева, при посеве мочи и секрета простаты на полужидкие среды Блаурокка и Шадлера была обнаружена анаэробная микрофлора: Eubacterium sp. 10 5 КОЕ/мл и Propionibacterium sp. 10 6 КОЕ/мл. Больному была проведена комбинированная антибиотикотерапия в соответствии с полученной антибиотикограммой. Побочных эффектов терапии не отмечено. К 4 неделе лечения обнаружена нормализация общих и бактериологических анализов мочи, а к 8 неделе посев секрета простаты выявил: Staphylococcus epidermidis 10 1 КОЕ/мл и Propionibacterium sp. 10 1 КОЕ/мл. В течение одного года наблюдения рецидивов простатита не наблюдалось. Анализы секрета простаты оставались в норме.
По заявляемой методике обследованы 72 больных по поводу инфекции верхних и нижних мочевых путей, а также половых органов:
Острый пиелонефрит: 11 больных,
Хронический пиелонефрит: 15 больных,
Хронический цистит: 27 больных,
Хронический простатит: 22 больных,
Хронический везикулит: 5 больных,
Хронический эпидидимит: 2 больных.
При стандартном и расширенном бактериологическом исследовании были получены следующие результаты, представленные в таблице 3.
Таблица 3
Видовой спектр микробов
Стандартные среды: МПА, КА, сахарный бульон
Модифицированный состав сред: МПА, КА, сахарный бульон + полужидкие среды Блаурокка и Шадлера
представители семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Enterococcus faecalis, Corynebacterium sp., Pseudomonas aeruginosa и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии.
представители семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Enterococcus faecalis, Corynebacterium sp., Pseudomonas aeruginosa и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии. Peptococcus sp., Peptostreptococcus sp., Propionibacterium sp., Bacteroides sp., Prevotella sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp.
Во всех случаях имела место микс-инфекция аэробов и анаэробов. Лечение антибиотиками проводили в соответствии с чувствительностью аэробов и анаэробов. Чувствительность аэробов и анаэробов не совпадала в 70% случаев. В этих ситуациях проводили лечение антибиотиками, к которому была чувствительна анаэробная флора. Окончательные результаты лечения:
Преимущества заявляемого способа состоят в том, что способ может применяться как для диагностики, так и для контроля лечения. Использование в качестве биологического материала для исследований мочи, секрета предстательной железы, эякулята расширяет возможности клинического использования метода. Заявляемый способ определения бактериологической обсемененности субстрата прост в применении и может быть использован в условиях любой практической лаборатории.
Способ определения бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы и эякулята путем посева мочи, секрета предстательной железы, эякулята на плотные питательные среды и выявления бактерий, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют посев этих субстратов на полужидкую среду Блаурокка и бульон Шадлера в последовательных разведениях от 10 -1 до 10 -10 и выявляют неклостридиальные анаэробные бактерии.
источник
Бактериологический посев (культуральное или микробиологическое исследование) — лабораторное исследование,при котором биоматериал,в котором предположительно могут находиться патогенные микроорганизмы,помещают в благоприятную для их размножения среду при определенных температурных параметрах с последующей оценкой результатов и определения чувствительности к антибактериальным препаратам.
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) из-за высокой цены и длительного срока проведения не рекомендует применять культуральное исследование в повседневной практической практике при наличии других методов диагностики (окраска по Граму,ПЦР) и при выраженной клинической картине заболевания.
Метод ценен для определения условно-патогенной микрофлоры,определения чувствительности к антибиотикам.Постепенно в практике заменяется полимеразной цепной реакцией (ПЦР)Преимуществом культурального метода явялется относительно высокая специфичность исследования и возможность лабораторного моделирования терапевтического воздействия на микроорганизмы и учет его эффективности — т.е. то,что обычно называют антибиотикограммой. Недостатками являются длительность исследования,высокие требования к забору материала,повышенные требования к квалификации персонала лабораторий,что ведет к значительному удорожанию стоимости исследования и удлинению сроков лечения. Лично я скептически отношусь к проведению различных бактериологических исследований,так как в большинстве случаев проблему излечения пациента удается решить в сроки,когда результаты бактериологического исследования еще не готовы.
В современной венерологии редко приходится прибегать к бактериологическому методу исследования.По моему мнению в России отмечается некоторое злоупотребление этим методом,связанное с коммерческим интересами лабораторий и нежеланием или незнанием врачами методов синдромной диагностики и лечения половых инфекций. Несомненными показаниями к проведению бактериологического исследования являются два заболевания : воспалительные заболевания малого таза у женщин и простатит у мужчин.С юридической точки зрения бактериологическое подтверждение диагноза гонококковой инфекции требуется при обнаружении в мазке грамотрицательных диплококков у девочек, пожилых женщин и беременных .В некоторых случаях исследование необходимо при хроническом,торпидном уретрите у мужчин и рецидивирующем вульвовагините у женщин.
Материал для исследования:отделяемое из очагов поражения.Материал может браться не только из половых органов,но и из полости рта,прямой кишки.Правила забора аналогичны забору при ПЦР-диагностике.Сроки выполнения различны от нескольких дней до нескольких недель(зависят от определяемого возбудителя).Для забора материала используются стерильные специальные инструменты или тампоны.Материал помещают в транспортную среду,если забор проводится вне лаборатории и в дальнейшем его помещают в специальные питательные среды.В зависимости от задач исследования применяют множество сред с добавлением различных биопрепаратов и химических соединений.Питательная среда с внесенным материалам помещается в специальные приборы(термостаты),в которых создается и автоматически поддерживаются условия,необходимые для размножения микроорганизмов (температура,влажность,газовая смесь и.т.д.).По истечению определенного времени проводят контрольные проверки-осмотры питательных среды.Рост микроорганизмов происходит в виде так называемых колоний,обладающих видимыми характеристиками — размер,плотность,форма,цвет и.т.д.При необходимости проводится микроскопическое исследования материала,взятого из колоний с окраской специальными красителями.Для того,чтобы дифференцировать микроорганизмы,сходные по типу колоний и (или) микроскопической картине проводят дополнительное исследования по способностям микроорганизмов разлагать некоторые неорганические и органические соединения — так называемое исследование с помощью биохимического ряда.Для определения количественных показателей используют различные методы,о которых сказано ниже.Выделенный и определенный микроорганизм называют культурой. Задача упрощается в тех,случаях,когда посев материала проводят на специальные среды,на которых могут размножаться только определенные виды микробов.(например среда Маккоя для определения хламидий).
Интерпретация результатов микробиологического исследования материалов, полученных при обследовании половых органов представляет определенные трудности,и, в значительной мере, зависит от опыта врача-лаборанта и правильности техники проведения исследования.В результате проводимого исследования определяется микроорганизм или микроорганизмы,по наличию которых можно предполагать,что он (они) являются причиной патологических изменений в мочеполовых органах.В большинстве случаев помимо качественного определения (наименования микроорганизма) проводят и количественную оценку культуры.Наиболее простым методом оценки является определения степени роста:
На плотной питательной среде рост до 10 колоний микроорганизмов определенного вида.
На плотной питательной среде рост от 10 до 100 колоний.
На плотной питательной среде рост более 100 колоний.
В случае роста условно-патогенных микроорганизмов I и II степени роста чаще всего свидетельствуют о загрязнении, III и IV степени роста — об этиологической роли данного микроорганизма в воспалительном процессе.
Колониеобразующая единица ( colony-forming unit -CFU) — одна живая микробная клетка, из которой вырастает колония,по другим определениям — в идимая колония микроорганизмов, выросшая из одной клетки или из группы клеток.Определение КОЕ теоретически позволяет определить концентрацию(количество) микроорганизмов в единице объема.Если определения количества микроорганизмов например в 1 мл мочи или в 1 мл спермы не вызывает возражений и может приниматься во внимание при определении тактики лечения заболевания,то количественное определение микроорганизмов в отделяемом из половых органов (влагалища,уретры) вызывает большие сомнения — так в любом случае,независимо от методов подсчета,определяется количество микроорганизмов только во взятой пробе из половых органов,а не во влагалище,цервикальном канале или уретре в целом.
Поэтому определение различных «титров», «степеней», «количества» микроорганизмов в пробах,взятых из отделяемого влагалища и уретры не имеет никакого практического значения ни для диагностики мочеполовых инфекций,ни для назначения лечения,ни для контроля их излеченности.
Подсчет КОЕ проводят несколькими методами:
Метод серийный разведений
Из транспортной среды,содержащей биоматериал берется 1 мл,который последовательно разбавляется в 10 раз с посевом в пронумерованные пробирки с питательной средой.Та пробирка,в которой прекращается рост микроорганизмов считается максимальной границей количества микроорганизмов в пробе.Для примера количество концентрация микроорганизмов в нижеприведенной таблице составляет 10х 6
источник
Анализ мочи Посев мочи и определение чувствительности обнаруженных микробов к антибактериальным препаратам – наиболее востребованные микробиологические исследования в клинических лабораториях. После дыхательной (респираторной) системы, мочевыделительная система больше всего подвержена инфицированию. Микробиологический анализ мочи проводится в бактериологической лаборатории. Эти анализы назначают с целью постановки (или исключения) диагноза инфекционных заболеваний мочевыделительной системы у пациентов без явных симптомов, которые подвержены риску инфицирования мочевыводящих путей.
Для проведения микроскопического исследования требуется чистая средняя порция мочи (см таблицу 1). Необходимо, чтобы этот образец был взят до начала терапии антибактериальными препаратами, поскольку они быстро оказывают эффект и титр (количество) бактерий быстро снижается, в результате чего результаты анализа будут искажены. В том случае если пациент уже принимает антибактериальные препараты, это нужно указать в направлении на исследование.
ТАБЛИЦА 1. Получение чистой средней порции мочи
Получение из мочевого пузыря образца мочи без бактерий, которые могут попасть в порцию мочи из:
— Кожи — Наружных половых органов — Перианальной области — Нижней трети уретры — Окружающей среды (на любых поверхностях вне контейнера для сбора мочи)
Любые бактерии, находящиеся в уретре, вымываются первой порцией мочи при мочеиспускании (эту порцию не собирают для анализа). Другие потенциальные возможности попадания бактерий в образец мочи для анализа необходимо избегать путем соблюдения определенных правих асептики.
Протокол сбора мочи для женщин
1. Тщательно вымыть руки с мылом и высушить 2. Пальцами одной руки раздвинуть половые губы 3. Вымыть с мылом область вокруг отверстия уретры (мыть нужно в направлении спереди-назад) и высушить 4. При мочеиспускании небольшую порцию мочи (примерно 20 мл) выпустить в унитаз, остальную порцию мочи собрать в стерильный контейнер для сбора мочи 5. Сразу закрыть контейнер крышкой (пробкой), не касаясь при этом краев контейнера или внутренней поверхности крышки (пробки)
Протокол сбора мочи для мужчин
1. Тщательно вымыть руки с мылом и высушить 2. Отодвинуть крайнюю плоть и вымыть с мылом область отверстия уретры с мылом 3. При мочеиспускании небольшую порцию мочи (примерно 20 мл) выпустить в унитаз, остальную порцию мочи собрать в стерильный контейнер для сбора мочи 4. Сразу закрыть контейнер крышкой (пробкой), не касаясь при этом краев контейнера или внутренней поверхности крышки (пробки)
В свое время взятие мочи для микробиологического анализа проводили путем катетеризации. И эта методика была широко распространенной до тех пор, пока не обнаружили, что сам процесс катетеризации несет большой риск инфицирования. Тем не менее этот способ применяют и сегодня у пациентов с постоянным катетером. В дренажной сумке катетера любые бактерии в моче быстро размножаются. Поэтому забор мочи из дренажной сумки не проводят, поскольку это исказит показатель титра бактерий мочи в мочевом пузыре.
Для проведения микробиологического анализа при постоянной катетеризации пациента, забор мочи проводят из изолированного рукава дренажной трубки при помощи шприца и иглы, соблюдая правила асептики. В этом случае асептика очень важна по следующим причинам:
Минимизация риска инфицирования пациента с установленным катетером
Минимизация риска возможного перекрестного инфицирования медицинского персонала и окружающих (в том числе других пациентов)
Минимизация риска попадания в образец мочи для анализа бактерий из окружающей среды.
Для микробиологического исследования мочи идеальным образцом считается моча, взятая непосредственно из мочевого пузыря. В здоровом состоянии моча всегда стерильна. Если в моче выявляют бактерии, это свидетельствует о патологическом процессе. С помощью аспирации путем надлобковой пункции можно получить мочу не загрязненную бактериями в дистальном отделе уретры.
Это инвазивная процедура, при которой в надлобковой области стерильной иглой прокалывают кожу и мышцы живота. Поскольку аспирация потенциально опасна, ее проводят только в случае, если невозможно получить чистую порцию мочи (например, у детей младшего возраста).
Для проведения микробиологического анализа мочу нужно собирать в стерильную посуду. Необходимое количество мочи для исследования – 5-10 мл, поэтому не обязательно полностью заполнять емкость.
Моча является подходящей средой для развития бактерий. То есть, любые бактерии, которые находятся в моче на момент ее сбора, продолжают размножение в лабораторной емкости. В результате такого роста результат анализа может быть ложным. Поэтому необходимо доставить в лабораторию образец мочи не позднее чем через 2-3 часа с момент сбора, а в направлении нужно указать время взятия образца. Если по каким-либо причинам образец невозможно доставить в лабораторию в указанный промежуток времени, либо доставка задерживается, мочу нужно хранить в холодильнике (при низких температурах рост бактерий замедляется).
Посев мочи непосредственно после ее сбора можно проводить с помощью современных методов. Для этого используют специальную пластинку, покрытую питательной средой (пластинка погружается в образец мочи, высушивается и отправляется в лабораторию).
Доставленный в лабораторию образец мочи для микробиологического исследования проходит следующие этапы:
Макроскопический осмотр
Микроскопическое исследование
Посев на питательную среду с целью обнаружения бактерий
В случае выявления в моче патогенных микроорганизмов, проводят определение их устойчивости и чувствительности к ряду антибактериальных препаратов.
Моча здорового человека в норме прозрачная и имеет желтый или желто-соломенный цвет. Конечно, по внешнему виду мочи нельзя ставить диагноз или делать какое-либо заключений, но присутствие инфекции в моче можно предположить. Инфекция мочевыделительной системы, как и другая инфекция, сопровождается привлечением большого количества лейкоцитов для борьбы с микробами. В области инфекционного поражения выделяется гной – воспалительный экссудат, который содержит погибающие и мертвые клетки. Одной из причин помутнения мочи является наличие гноя – пиурия (лекоцитурия). Тем не менее, прозрачная моча (без мути) не гарантирует отсутствие инфекции, как и мутная моча не является точным признаком инфицирования (помутнение мочи может происходить по другим причинам). Кроме этого, при инфицировании некоторыми видами бактерий моча может приобретать неприятный запах.
Микроскопическое исследование мочи предполагает анализ определенного объема полученного образца под микроскопом на предмет наличия эритроцитов и лейкоцитов. В здоровом состоянии моча может содержать незначительное количество этих клеток. Значительное повышение количества лейкоцитов в моче свидетельствует об инфекционном процессе. Отметим, что повышение количества лейкоцитов в моче может наблюдаться при полном отсутствии бактерий, как и наличие явного очага инфекции в мочевыделительной системе без значительного повышения количества лейкоцитов. Гематурия (повышение количества эритроцитов в моче) может быть вызвана как инфекционным процессом, так и другими причинами (например, болезнь почек).
Также в моче могут обнаруживаться эпителиальные клетки, которые слущиваются с поверхности отделов мочевыделительной системы. У женщин в моче могут быть обнаружены эпителиальные клетки, которые слущиваются с половых путей, что не имеет никакого отношения к патологии мочевыделительной системы, а лишь свидетельствует о нарушении правил сбора мочи и может содержать бактерии из женского полового тракта.
Микроскопическое исследование, которое входит в перечень общего анализа мочи, позволяет обнаруживать бактерии, если они содержатся в большом количестве.
Гарантированно подтвердить или опровергнуть наличие в моче бактерий можно только в культуре мочи (культура мочи – совокупность жизнеспособных бактерий в моче). Бактериологическое исследование подразумевает размещение определенного объема мочи в чашке Петри на плотной культуральной среде, содержащей все необходимые компоненты для роста бактерий. Затем закрытую чашку Петри помещают в термостат при температуре 37°C (оптимальная температура для роста бактерий) на 24 часа. На поверхности плотной культуральной среды рост любых бактерий проявляется в виде образования колоний. В каждой колонии содержится огромное количество бактерий, которые произошли от единственной клетки микроорганизма, которая находилась в моче. Таким образом, количество колоний на культуральной среде позволяет определить количество микробных клеток в образце мочи. Если культуральная среда с размещенным в ней образцом мочи не изменяется (колонии не образуются), значит моча стерильна.
Учитывая тот факт, что моча здоровых людей может содержать небольшое количество бактерий из нижней трети уретры (см статью «Инфекция мочевыводящих путей» ), бактериурия (наличие бактерий в образце) не является основанием для постановки диагноза инфекционного заболевания мочевыделительной системы. Впервые термин «значительная бактериурия» применили микробиологи Касс и Финленд в 1956 году при диагностике инфекционного поражения мочевого тракта. Ученые выяснили, что, за некоторым исключением, если количество бактерий в 1 мл мочи превышает показатель 100 000 (10 5 ), можно ставить диагноз инфекции мочевыделительной системы. Более поздние исследование показали, что симптомы инфекционного заболевания могут возникать при меньшем количестве бактерий (10 3 /мл), а также, что при количестве бактерий более 10 5 /мл у некоторых пациентов, какие-либо симптомы инфекционных заболеваний полностью отсутствовали. Несмотря на это критерий Касса до сих пор широко применяется и наличие в моче бактерий в количестве более 10 5 /мл является основанием для постановки диагноза.
Начальную концентрацию бактерий в образце мочи определяют путем подсчета образовавшихся колоний при посеве известного объема мочи. Каждая колония возникает в результате деления одной клетки микроорганизма, поэтому колонии получаются чистыми (состоят только из одного вида бактерий). Каждый вид бактерий имеет специфический макроскопический вид колоний. Несмотря на это, для точной идентификации вида бактерий проводят другие исследования.
Инфекционное заболевание мочевыводящих путей могут вызывать несколько типов бактерий (чаще всего – EscherichiaColi, также известная как Кишечная палочка). Очень редко встречаются случаи смешанной инфекции (смешанная инфекция часто обнаруживается у пациентов с постоянным катетером). При обнаружении нескольких видов бактерий, когда в посеве не доминирует ни один из них, вероятнее всего, что бактерии в мочу попали в нижней трети уретры или из аногенитальной области (то есть, образец мочи был неправильно собран). Если на культуральной среде наблюдается рост колоний одного вида бактерий (чистый рост), количество которых превышает 10 5 /л, можно ставить диагноз инфекции мочевыводящих путей (см таблицу 2).
ТАБЛИЦА 2. Распространенные бактерии, вызывающие инфекционное поражение мочевыделительной системы
Физиологическое присутствие
Случаи инфекционного поражения мочевыделительной системы, %
Доля пациентов, инфицированных в стационаре, %
источник
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
УТВЕРЖДЕНЫ Министерством здравоохранения РСФСР от 19 декабря 1991 г.
Методические рекомендации составил А.Н.Калюк.
Бактериологические исследования на условно-патогенные микроорганизмы
Комплексное лабораторное изучение микрофлоры включает бактериоскопическое и бактериологическое исследования материала, проводимые в динамике при поступлении на стационарное лечение, в процессе лечения, а также по показаниям у больных, лечащихся амбулаторно. Посевы диагностического материала целесообразно производить на плотные питательные среды, что исключает подавление роста одного микроорганизма другим и позволяет дать количественную оценку числа выросших колоний. Интенсивность роста микроорганизмов может выражаться в крестах и соответствовать содержанию определенного количества микробных клеток в 1 мл диагностического материала:
++++ обильный рост сливающихся колоний (10 м/кл)
+++ массивный рост изолированных колоний (10 м/кл)
++ умеренный рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50) (10 -10 м/кл)
+ скудный рост единичных колоний (30-50) (10 м/кл).
При дозированном посеве определяют абсолютное содержание микроорганизмов в 1 мл или 1 г исследуемого материала. Этиологически значимым содержанием бактерий в 1 мл (1 г) материала признается 10 и выше. Количественное преобладание определенного вида микроорганизма является одним из показателей его участия в гнойно-воспалительном процессе. Окончательная интерпретация результатов бактериологического исследования производится после изучения анамнестических данных, клинической симптоматики, результатов антибактериальной терапии. При направлении материала на посев необходимо соблюдать определенные правила. Материал должен быть исследован до начала антибактериальной терапии или через такой период после введения антибактериальных препаратов, который необходим для их элиминации из организма больного (2-3 дня при анализах мокроты, 4-7 дней — мочи). Применение антибиотиков в 3-4 раза снижает частоту выделения микроорганизмов. Посевы диагностического материала проводятся в динамике (3-5 раз), что уточняет этиологию заболевания, дает возможность проследить длительность персистенции возбудителя, контролировать эффективность проводимой терапии. Интервал между сбором и посевом материала не должен превышать 1-2 ч.
Исследование микрофлоры верхних дыхательных путей (глотка, нос, ротовая полость). Материалом для исследования служат: слизь, гнойное отделяемое, корочки, пленка, кусочки инфильтратов при биопсии. Материал для микробиологического исследования из ротовой полости забирают натощак стерильным ватным тампоном со слизистой оболочки у выхода протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек (соскоб ложечкой), с наиболее пораженных мест. При наличии пленки последнюю снимают пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном. Материал засевают на чашки Петри с кровяным, желточно-солевым агарами, среду Сабуро. При посеве тампоном материал втирают в среду со всей поверхности тампона на небольшом участке 1-2 см , а затем штрихами по всей поверхности. Одновременно с посевом приготавливают мазки и окрашивают по Граму.
Исследование микрофлоры нижних дыхательных путей. Основным материалом для исследования является мокрота, которая собирается в день исследования, утром, после чистки зубов и полоскания полости рта свежекипяченой водой. При обильном выделении мокроты первые порции следует откашлять в плевку, а последующие собираются в стерильную посуду и доставляются в лабораторию. Для изучения микрофлоры мокроты применяют как посев неразведенной мокроты (качественный метод), так и метод разведения, который получил название количественного. При качественном методе для посева используются гнойные комочки мокроты, отмытые в физиологическом растворе от микрофлоры ротовой полости. При количественных методах гомогенизируется 1 мл мокроты. Затем производятся разведения, позволяющие уменьшить в ней количество микроорганизмов ротовой полости. При обоих методах одновременно с посевом приготавливается мазок, который окрашивается по Граму. Исследованию подлежат гнойная и слизисто-гнойная мокрота, в которой присутствуют лейкоциты и клетки альвеолярного эпителия, клетки, вкрапленные в муцин, присутствие которых характерно для экскрета нижних отделов дыхательных путей. Обращают внимание на преобладающую в мазке нативной мокроты микрофлору, особенно капсульные диплококки (пневмококки), мелкие грамотрицательные палочки (палочка Пфейффера) и др.
Качественный метод. В лаборатории мокроту выливают в чашку Петри, выбирают 2-3 гнойных комочка, которые однократно отмывают в физиологическом растворе, после чего засевают на кровяной и желточно-солевой агары, среды Эндо и Сабуро. Посев производят стерильным стеклянным шпателем, равномерно растирая материал на поверхности питательной среды. На чашку с кровяным агаром сразу же после посева накладывают диски с антибиотиками (стрептомицином, пенициллином, тетрациклином, эритромицином и левомицетином), что позволяет получить экспресс-информацию о лекарственной чувствительности преобладающей в посеве микрофлоры. На второй день учитывают количество выросших колоний (этиологически значимым считается рост более 50 колоний), однородность популяции и лекарственную чувствительность при росте их в монокультуре.
Количественный метод. Из доставленной в лабораторию мокроты берут 1 мл, добавляют 9 мл мясопептонного бульона и гомогенизируют в банке с бусами в течение 20 мин. Из полученной эмульсии готовят десятикратные последовательные разведения. Посев осуществляют в обратном порядке с меньшего разведения. Засевается по 0,1 мл из разведенной мокроты 10 и 10 на чашку с кровяным агаром. Посев на желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро делают из исходного разведения 1:10. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. На вторые сутки чашки просматривают и учитывают численность каждого из видов микроорганизмов в миллионах. Диагностически значимым признается содержание бактерий 10 м/кл и выше в 1 мл мокроты.
Посев промывных вод бронхов, лаважной жидкости. Из исследуемого материала отбирают комочки слизи, которые без предварительного отмывания в физиологическом растворе засевают на плотные питательные среды (см. посев мокроты) и в пробирку с сахарным бульоном. При отсутствии комочков слизи производят посев материала, набранного в пастеровскую пипетку. Инкубация в течение суток при 37°С.
Исследование микрофлоры глаз. Пробы на исследование отбирает врач стерильным ватным тампоном или стеклянной палочкой. Материал забирается с пораженных мест и засевается в 0,5% сахарный бульон. В случае отсутствия роста через 48 часов выдается отрицательный ответ.
Исследование мазков из уха. Материал забирают стерильным ватным тампоном из слухового канала и производят посев на кровяной и желточно-солевой агары, среду Сабуро, втирая материал на участке среды, после чего растирают по всей чашке.
Исследование мочи. Исследованию подлежит средняя порция утренней мочи, полученная при нормальном мочеиспускании или взятая катетером. Показателем бактериурии, имеющим клиническое значение, считается наличие 100000 и более микробов в 1 мл мочи.
Первый день исследования. Производят посев одной стандартной (3 мм) бактериологической петли мочи (тщательно перемешанной) по секторам А, I, II и III в чашку Петри с 5% кровяным или простым агаром. При этом в участке среды сектора А делают посев, равномерно втирая материал по всей поверхности, затем не беря нового материала, этой же петлей делают посев штрихами на питательную среду в секторе I (3-4 штриха), из сектора I во II, из II сектора — в III.
Число колоний бактерий в различных секторах чашки Петри в зависимости от степени бактериурии (по В.С.Рабиновскому и В.В.Родоман)
Количество бактерий в 1 мл мочи
Число колоний в различных секторах чашки Петри
Второй день исследования. Определяют степень бактериурии по табл.1 в зависимости от того, в каком секторе обнаружен рост колоний микроорганизма. При наличии менее 100 тыс. микробов в 1 мл мочи рост колоний наблюдается только в секторе А чашки Петри. Появление роста колоний в I секторе указывает на более высокую степень бактериурии. Подсчет колоний в секторе с наименьшим ростом не представляет труда. Метод секторных посевов в большинстве случаев позволяет уже на второй день исследования выделить возбудителя заболевания в чистой культуре.
Исследование микрофлоры ран, пунктатов, экссудатов, резецированных тканей. Экссудаты и пунктаты засевают пастеровской пипеткой в пробирки с кровяным и простым мясопептонным агаром, сахарным бульоном. Тампон с диагностическим материалом засевают на чашки Петри с 5% кровяным и 10% желточно-солевым агарами. Материал втирается по краю среды, а затем рассеивается по чашке при помощи этого же тампона или бактериологической петли.
Исследование микрофлоры женских половых органов. Выделения собирают с помощью стерильного ватного тампона и засевают на чашки Петри с 5% кровяным агаром, желточно-солевым агаром и в пробирку с сахарным бульоном, а также на среду Эндо.
Исследование желчи. Желчь собирают при зондировании или во время операции в стерильные пробирки и доставляют в лабораторию не позднее 2 ч. от момента забора. 0,1 мл желчи высевают на чашку с кровяным агаром и на среду Эндо. Посевы и оставшийся исходный материал помещают в термостат при 37°С. Через 24 часа учитывают результаты первичных посевов с подсчетом количества колоний каждого вида на плотных питательных средах.
Исследование крови. Кровь сеют у постели больного после тщательной обработки кожи (спирт, эфир). Из локтевой вены берут 10 мл крови, которую выливают в две колбы: первую со 150-200 мл сахарного бульона и вторую с тиогликолевой средой (по 5 мл). Посевы выдерживают в термостате в течение 10 дней. На 2, 3, 5 и 10-й дни производят контрольные высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром. Посев 5 мл крови можно произвести во флакон с питательной средой в двух фазах: плотной и жидкой (скос 5% кровяного агара с 1% глюкозы и 50 мл 0,5% сахарного бульона). Такая методика исключает необходимость многократных пересевов, устраняет возможность загрязнения посева микрофлорой окружающей среды, позволяет учесть количество выросших колоний (т.е. оценить напряженность бактериемии). Посев помещают в термостат при 37°С на 10 суток. Ежедневно содержимое флаконов взбалтывают и наклоном флакона смачивают поверхность скоса плотной питательной среды. При появлении роста колоний на скосе кровяного агара с них приготавливают мазки и далее идентифицируют по общепринятым в бактериологии правилам. При отсутствии роста микроорганизмов на 10-е сутки дается окончательный ответ — посев крови стерилен.
Исследование на дисбактериоз кишечника. На предварительно подготовленные и взвешенные (подпергамент или вощанку) стерильные бумажки размером 3×2 берут произвольное количество фекалий и взвешивают на торзионных весах. Бумажку вместе с материалом помещают в стерильную пробирку. Вес навески фекалий, за вычетом веса бумажки, умножают на 9. Полученная после умножения сумма равна количеству физиологического раствора, которое необходимо добавить в пробирку. Разведение 1:10 (I).
Например: вес бумажки 20 мг
вес фекалий с бумажкой 420 мг
420-20=400 мг; 400 мг 9=3600 (3,5 мл).
После эмульгирования стеклянной палочкой или стерильной пипеткой взвеси дают отстояться при комнатной температуре 10-15 мин и 0,1 мл переносят в следующую пробирку с 9,9 мл физиологического раствора (разведение 10 ). Затем производят разведение фекалий до титра 10 . Из основного разведения (10 ) производят посев на плотные питательные среды для выделения патогенных микробов семейства кишечных (среду Плоскирева, Левина). Одновременно делают массивный (0,5-1,0) посев на жидкие среды обогащения (Мюллера, селенитовую, магниевую). Из пробирки, в которой фекалии разведены до 10 , вносят по 0,1 мл на поверхность среды Сабуро и ЖСА. Из разведения 10 производят посевы на чашки с 0,5% кровяным агаром и среду Эндо по 0,1 мл. Для получения роста изолированных колоний применяют стеклянные бусы или шпатели. Стеклянные круглые бусы 12-14 штук (заранее простерилизованные) опускают в чашку с посевным материалом. При легком покачивании чашки с бусами в течение 1 мин материал равномерно распределяется по питательной среде. Посев бусами начинают со среды, на которой посеяно наибольшее разведение (10 ), перенося бусы на меньшее разведение. Для выделения анаэробных бифидобактерий производят высев из разведений 10 , 10 и 10 в 2 пробирки (по 0,1 и 1 мл) регенерированной в течение 1 ч среды Блаурокка. После посева пробирки энергично вращают между ладонями для равномерного распределения взвеси. Среды для выращивания аэробов помещают в термостат при 37°С (Сабуро — при 20°) на 18-24 часа. Рост анаэробов на среде Блаурокка учитывают через 48-72 ч. На следующий день после посева определяют количество кишечной палочки и других микробов в 1 г фекалий по числу колоний, выросших на соответствующей питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степени его разведения. Так, если на среде Эндо выросло 30 лактозонегативных колоний при посеве 0,1 мл фекалий из разведения 10 (1:100000), при расчете следует 30 умножить на 10 и на 100000, т.е. в 1 г будет 30000000 лактозонегативных энтеробактерий. Учитывают число лактозонегативных и гемолитических колоний кишечной палочки, наличие стафилококка, протея и других микроорганизмов. Определяются ферментативные свойства и лекарственная чувствительность микроорганизмов. Из пробирок со средой Блаурокка приготавливаются мазки. Под микроскопом бифидобактерий имеют вид характерных грамположительных палочек, утолщенных или разветвленных на концах, расположенных в виде римской цифры V, часто в виде скоплений. В ответе бактериолога указываются процент или абсолютное количество каждой группы микроорганизмов.
Идентификация микроорганизмов. Методы идентификации микроорганизмов основаны на изучении морфологических, культуральных и биохимических, антигенных и др. свойств культур.
Морфологические свойства изучаются путем бактериоскопии диагностического материала и мазков из колоний, выросших на плотных и жидких питательных средах культур. Мазки на предметных стеклах фиксируют на пламени горелки или в жидких фиксаторах (96°, спирт, смесь Никифорова) окрашивают по Граму. При просмотре мазков из мокроты оценивают всю имеющуюся микрофлору: наличие скоплений грамположительных кокков (стафилококки, микрококки), цепочек грамположительных кокков (стрептококки), мелких ланцетовидных диплококков, окруженных зоной неокрасившейся капсулы (пневмококк), грамотрицательных кокков (нейссерии); грамотрицательных палочек (кишечная, синегнойная, протей); грамотрицательных палочек с закругленными концами, окруженных капсулой в виде светлого ореола (клебсиелла), мелких грамотрицательных палочек в виде скопления (гемофильные бактерии) и др. Бактериоскопическое исследование является ориентировочным. Дальнейшее исследование включает посев материала на питательные среды, выделение чистых культур, их идентификацию и определение лекарственной чувствительности. Культуральные свойства изучают при просмотре выросших культур на плотных и жидких питательных средах. На плотных средах учитывают размер колоний, цвет, прозрачность, форму, наличие пигмента, гемолиз вокруг колонии и его характер и т.д. На жидких средах отмечают их прозрачность, наличие осадка (придонный рост) или пленки на поверхности среды. Исследование биохимических свойств основывается на определении ферментативной сахаролитической активности, способности утилизировать питательные вещества в аэробных и анаэробных условиях культивирования. Антигенные свойства культур изучаются при взаимодействии бактерий и их антигенов с соответствующими антисыворотками (реакции агглютинации, иммунофлюоресценции и др.). После изучения морфологических и культуральных свойств осуществляют постановку дифференциальных тестов с чистыми культурами микроорганизмов.
Грамположительные кокки. Грамположительные кокки относятся к семейству Micrococcaceae, включающему род Micrococcus и Staphylococcus и семейства Streptococcaceae.
Семейство Micrococcaceae. Для медицинской микробиологии необходимо дифференцировать стафилококки от микрококков. Изучают морфологические свойства, гемолиз, способность расти на среде с солью, пигментообразование, ферментацию глюкозы до кислоты в анаэробных условиях, ферментацию глицерина. Микрококки имеют в 2-3 раза больший размер клеток (0,5-3,5 мкм), не ферментируют глюкозу в анаэробных условиях и глицерин, имеют пигмент от желтого до розового. Дифференциация различных видов стафилококка осуществляется по комплексу тестов: плазмокоагулирующей способности, лецитиназной активности, ферментации маннита в анаэробных условиях, пигментообразованию, чувствительности к новобиоцину (тест — положительный у St. aureus и St. epidermidis и отрицательный у St. saprophyticus). Для выделения стафилококка исследуемый материал засевают на дифференциально-диагностическую среду: желточно-солевой агар. При окраске по Граму стафилококк окрашивается грамположительно и располагается одиночно, попарно или образует скопления в виде неправильных кучек. Стафилококк устойчив к повышенным концентрациям в среде хлористого натрия (7-10%), что используется для его выделения из патологического материала. При росте на мясопептонном бульоне вызывает его равномерное помутнение и дает хлопьевидный осадок. На плотных питательных средах стафилококк растет в виде круглых блестящих колоний с ровными краями (0,5-1,5 мм в диаметре). На второй день исследования оценивают количественный рост выросших колоний, учитывают лецитиназную активность, выделяют чистую культуру микроба (пересев на пробирки с молочным или простым скошенным агаром). На третий день — ставят тесты для дифференциации и на лекарственную чувствительность.
При определении коагулазной активности пользуются лиофилизированной плазмой крови кролика, разведенной стерильным физиологическим раствором 1:5 и разлитой в стерильные пробирки по 0,5 мл в каждую. В пробирку засевают 1 петлю суточной агаровой культуры исследуемого штамма и помещают в термостат при 37°С. Учет результатов производят через 30 мин, 1 час, 2 часа и 24 часа. Положительными считаются все степени свертывания плазмы от небольшого сгустка, остающегося неподвижным при перевертывании пробирки.
Лецитиназная активность определяется на желточно-солевом агаре. Учет реакции производят через 24-48 часов макроскопически по наличию мутной зоны и радужного венчика вокруг колоний стафилококка, что свидетельствует о наличии у них фермента лецитиназы.
При изучении ферментации маннита посев суточной агаровой культуры испытуемого штамма производят уголком в столбик 1% агара с маннитом и вазелиновым маслом. При ферментации маннита столбик агар синеет. Положительной считается реакция при ферментации 2/3 столбика агара.
Для определения пигментообразования культуры стафилококка засевают на 10% молочный агар. Учет через 18-20 часов.
Определение гемолитической способности культуры стафилококка осуществляется на 5% кровяном агаре (донорская кровь без добавления антисептиков) по наличию просветления вокруг выросших колоний, которые четко выявляются в проходящем свете. Положительный гемолитический тест на агаре с кровью человека, как правило, обусловлен гемотоксинами, тогда как основную роль в патогенезе стафилококковых инфекций играет альфа-токсин, который можно выявить на агаре с кровью кролика.
Семейство Streptococcaceae. Стрептококки представляют собой большую и довольно гетерогенную группу микроорганизмов. Наиболее изученными являются аэробные представители: Streptococcus pyogenes, S. faecalis, S. pneumoniae. Микроб имеет сферическую форму, грамположителен, в мазках с плотных питательных сред располагается в виде коротких цепочек из 2-3 кокков, на жидких питательных средах дает более длинные цепочки. При выращивании стрептококков следует учитывать их повышенную потребность в питательных веществах. Поэтому для культивирования стрептококка применяют питательные среды, содержащие глюкозу (1%), кровь (5-10%), сыворотку (10-20%).
Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».
Анализ мочи Посев мочи и определение чувствительности обнаруженных микробов к антибактериальным препаратам – наиболее востребованные микробиологические исследования в клинических лабораториях. После дыхательной (респираторной) системы, мочевыделительная система больше всего подвержена инфицированию. Микробиологический анализ мочи проводится в бактериологической лаборатории. Эти анализы назначают с целью постановки (или исключения) диагноза инфекционных заболеваний мочевыделительной системы у пациентов без явных симптомов, которые подвержены риску инфицирования мочевыводящих путей.